关于积分,外部的关注点主要是合规性。而作为具体岗位色谱分析师或分析方法研究人员,显然,只关注合规性是不足的。那么,从头扒一扒,梳理一下自己的知识,以期提高。
色谱学里面主要用到保留时间、峰面积、峰高来识别、判定成分的类别、含量、纯度等。峰高、峰谷和保留时间这三个问题很好解决,看时间-峰值切片对应拐点-斜率变化就可以了,除非阈值选值有问题或者GPC领域,一般没有变化。那么,峰面积就成了最后一个需要解决的问题了,这也是合规性或者研究数据科学性需要重点考虑的。
峰面积是积分的结果,而积分就是无限微分后的无限积分(俗话就是切片面积和)。然后通过与对照品峰面积比、自身峰面积占比等数据处理方式进行校准、计算;而对于GPC领域,要用到的是保留时间与分子量对数的函数以及切片的重均、数均、Z均分子量分布等信息。也就是说,峰面积准不准是色谱学中最终数据可报告性的决定性因素。当然,并不是说一味的按照处理向导使用默认参数处理色谱峰就能获得科学可靠的结果。既然有积分参数,那么就需要根据方法特征进行研究、固化、调整。
正向思维,哪些因素与色谱峰面积有关呢?当你在上帝视角的时候,你能做些什么呢?
以下内容以Empower3 FR2为例,咱们各个参数逐项解析:
①第一屏,可见的几个参数有峰宽、阈值、最小峰面积、最小高度。
这一屏就可能存在多个上帝之手。峰宽、阈值这两项一般经过柱筛选、分离参数优化、峰纯度检测等一系列方法研究,已经能够可以固化,除非当遇到特殊保留行为时才需要调整。
因为峰宽、阈值又与系统适用性中某些参数直接相关,所以要解释一下:
峰宽:在峰的两侧拐点做切线和峰底相交两点间的距离。“传统”积分使用峰宽值来计算数据分组因子。峰检测期间,通过用“峰宽”与(采集数据时的)采样率的整数乘积除以 15 来确定用以在色谱中产生单个点的组合点数。
阈值:“传统”积分使用阈值参数(微伏/秒)来为峰检测指定峰起点和峰终点值(检测器信号的最小变化率)。软件会计算三组数据点上的斜率变化,然后将这一变化与“阈值”参数进行比较。当计算出的斜率变化超过阈值时,即会发生峰起落。
一句话:峰宽和峰是否苗条有关,阈值和你有多少个峰有关。
另外就是最小峰面积和最小高度这两项。如果被设置,就意味着峰/无效峰的剔除。如果对于杂质测定,设置这两项显然要谨慎,至少要和空白和标样重叠对比,用空白进行确认。否则手一抖、杂质就没了。
②“处理参数”这一屏,用于设置具体的积分参数。也是合规性审计中的隐身项。当然这些参数在合规设置使用的情况下,能够提高效率。
1.传统计分方法和ApexTrack积分方法(后者据说为waters打标TM的方法)。
传统积分方法可以设置的参数有峰宽、阈值、最小峰面积、最小高度。ApexTrack积分有顶点检测(开始、结束、峰宽、检测阈值)和峰积分(峰起点%、最小面积、最小高度)两栏参数。从原理上说:色谱峰积分包括三个步骤:峰检测、基线位置以及峰面积、峰高和保留时间的确定。那么检测过程应该和方法验证时使用相同的积分方法,这也考验方法转移、方法确认时应注意考虑足够多的详细信息。
传统积分执行下列功能:
A.自动为色谱确定适当的峰宽值和阈值,除非已在处理方法中设置,
限制:如果启用了“使用 V3.0x 的峰宽和阈值确定方法”系统策略,Empower 将无法自动确定峰宽和阈值。
B.检测色谱中的峰开始和结束点 。
C.积分峰以确定其保留时间、面积和高度
ApexTrack 积分:
该方法检测峰和定位基线的方法与传统积分方法的不同之处主要体现在以下几个方面:
ApexTrack 积分使用色谱的二阶导数检测峰。[传统积分使用斜率阈值(一阶导数)检测峰。] 峰检测参数独立于基线位置参数。[对于传统积分则不是这样。] 搜索算法从每个峰的顶点开始,向下向外计算,画出基线。当展开的基线相遇并融合时,簇即被确定。 ApexTrack 积分提供肩峰检测、改进的负峰检测和积分以及高斯切削。
另外,对于ApexTrack 积分,手动积分时,某些【作死动作】并不被ApexTrack 积分原则“顺从”:
为了能够在 ApexTrack 积分中扩展峰或簇时添加更多峰,Empower 软件会在 ApexTrack 手动积分期间忽略某些处理方法参数和事件。这些参数和事件是:“开始”、“停止”、“最小高度”、“最小面积”、“禁止积分”、“设置最小高度”、“设置最小面积”、“设置最大高度”和“设置最大宽度”。
③……
③但愿明天我有时间整理,先不说了。其实③就剩下十几个具体【作妖】参数了,列出来说明白就好了,非相关人员可忽视。