美国药典USP最新指南(附表) | 关于mRNA疫苗的质量分析方法(第三版)

本文来自"Synth Linker

RNA治疗策略主要有四种类型：

mRNA、反义RNA、RNA干扰(RNAi)和RNA适配体。在这四种类型中，只有基于mRNA的产品涉及将体外转录的mRNA递送到靶细胞中，然后细胞机制将mRNA转化为蛋白质。

有三种不同的方式利用mRNA：

1)疫苗接种——注射编码特定靶抗原的mRNA以引发保护性免疫；

2)细胞疗法——将mRNA转染到体外细胞中以改变细胞表型或功能。然后，将这些细胞输送到患者体内；

3)替代疗法——将mRNA注射到患者体内以补偿有缺陷的基因或蛋白质。

由于mRNA平台（即Covid-19疫苗）已被证实有效、产品设计和生产速度快以及与传统方法相比具有更大的灵活性，预计全球mRNA治疗和疫苗市场将在未来十年内大幅扩张。基于mRNA的疗法和疫苗正在开发中，用于治疗多种适应症，包括传染病、代谢疾病、癌症和心血管疾病。

mRNA 技术潜力巨大，质量管理至关重要，故需要一套通用的方法，建立共识对于推动这项技术的采用至关重要。

为了满足这一需求，USP（美国药典委员会）正在开发一套 mRNA 质量分析方法，以支持世界各地的开发商、制造商、监管机构和国家控制实验室。目标是建立对 mRNA 质量属性的总体共识，以加速产品开发、指导成功的制造规模扩大，并增强监管机构对在开发和制造这种新模式时采用最佳实践和适当质量控制的信心。

根据各利益相关方确定的需求，USP 和BIO3复杂生物制剂和疫苗专家委员会制定了本指南草案，作为制定 mRNA 疫苗测试程序指南的第一步。它包括分析程序和最佳实践，以支持对 mRNA 疫苗和治疗剂的共同质量属性的评估。

本指南草案以一般章节 <1235> 人用疫苗，一般注意事项和 <1239> 人用疫苗 - 病毒疫苗中描述的最佳实践为基础。

2022年2月，USP 和我们的 BIO3 专家委员会发布了指南草案的第一版，以征求全球利益相关者对所包含方法的反馈，并鼓励提交任何替代方法和其他支持文档，包括与指南草案中提出的方法相关的验证包。USP 收到了 300 多条评论、编辑和几份方法捐赠。在第二版中，利益相关者的反馈得到了解决，捐赠的方法被纳入其中。

2023年4月，USP 发布了第二版指南，以进一步收集全球利益相关者的反馈。在此阶段，USP 积极征求公众对修订后的 mRNA 指南草案的意见，并从各利益相关者那里获得了意见，并提供了几种捐赠的方法。随着第三版的发布，USP 已细致地处理了公众意见，并将收集的方法整合到指南中。此外，USP 对几种关键质量属性 (CQA) 的方法进行了评估，并将这些方法纳入了指南草案。

此第三版的主要更新包括：

• 将表1替换为改编自已在药典论坛上发布的拟议 USP 章节 <1040> 的新版本;

• 添加了LC-MS 方法用于 5' 封端效率;

• 添加了LC-MS 方法用于 3' poly(A) 尾长;

• 更新免疫印迹方法;

• 在AEX-HPLC的mRNA方法中添加了残留NTP和封端剂;

• USP已评估以下方法:

– LC-MS法测定3'poly(A)尾长;

– 免疫印迹法测定 dsRNA 杂质;

– AEX-HPLC法测定mRNA中残留NTP和封端剂;

– CGE法测定mRNA完整性;

– IP-RP-HPLC法测定mRNA纯度。

为了进一步支持用于基于mRNA的疫苗和疗法的分析方法的质量和一致性，USP已开始对USP实验室中的几种方法进行评估，目的是对这些方法进行鉴定和/或验证。在某些情况下，如果该方法适用于广泛的mRNA产品，则方法可能会作为文献标准（例如，包含经过验证的方法的通用章节）。

这些拟议的药典方法将在药典论坛上发布，在作为USP-NF章节发布之前征求公众意见。在其他情况下，由于开发中的mRNA产品种类繁多，标准化更具挑战性，方法和其他相关信息可能会在药典流程之外发布（例如，指南草案、技术说明或科学出版物）。

需要更多合作

为了推进这些指南草案，我们邀请对mRNA疫苗和技术有经验或兴趣的行业、学术和政府专家就这些指南草案中详述的方法提供反馈，并推荐支持理解 mRNA 质量的更多信息。我们鼓励提交任何替代分析方法以及支持文件（例如验证文档）。通过与 USP 合作，参与者在制定标准和解决方案方面发挥积极作用，这些标准和解决方案有助于建立全球人民可以信赖的安全、有效、优质的药物供应。

简介

天然存在的 mRNA 是在真核细胞中通过 RNA 聚合酶转录细胞核中的 DNA 而产生的。mRNA 分子从细胞核运输到细胞质，在那里它们作为模板由核糖体翻译产生蛋白质。通过这种方式，存储在基因组中的信息用于表达特定蛋白质。mRNA 不能产生除其编码的蛋白质之外的任何蛋白质。

目前已开发出两种主要形式的 mRNA 疫苗：非复制型 mRNA 疫苗（常规）和自扩增型 mRNA (SAM) 疫苗，如下图 1 所示。常规的非复制型 mRNA 疫苗构建体由 5′-7-甲基鸟苷帽结构、5′ 非翻译区 (UTR)、编码靶蛋白的开放阅读框 (ORF)、3′-UTR 和 3′ 聚 (A) 尾组成。SAM 疫苗源自 alphavirus 基因组，其中 mRNA 分子还编码可指导细胞内 mRNA 扩增的复制酶。在这两种形式的 mRNA 疫苗中，UTR 区域对于调节蛋白质表达、阻止核酸外切酶介导的 mRNA 降解和提高翻译效率都很重要。UTR、5' 帽和 poly(A) 尾也有助于稳定细胞内的 mRNA 分子本身。

图1 两种主要类型的mRNA疫苗

有几种方法可以制造mRNA药物物质，包括使用PCR生成的模板或具有终止子序列的非线性质粒。mRNA药物物质模板可以通过宿主细胞（例如大肠杆菌）的扩增来制备。无论哪种情况，在制造mRNA疫苗时使用的每批质粒DNA都必须经过测试，以确认其身份、纯度和质量，然后才能放行。质粒DNA被视为GMP级起始材料，并且必须从初始细胞库阶段开始按照GMP原则制造。管理细胞库和测试建议的最佳实践在通用章节 <1042> 重组生物制剂的细胞库实践中进行了描述。

下表1总结了属性和建议方法，这些属性和建议方法在目前 PF <1040> 中拟议的通用章节中进行了更详细的描述，质粒DNA作为细胞和基因治疗的起始材料的质量考虑。本通用章节的目的是描述作为起始材料使用的质粒的生产和发布测试的注意事项。该文件于2023年11月在药典论坛 (PF) 49(6)上发表，为期90天的公众意见征询期。目前，收到的公众意见正在由专家小组审查，随后由专家委员会审查。

表1 质粒DNA质量属性，USP第1040章

mRNA 药物物质和药物产品的质量取决于其设计、开发以及在开发和制造过程中应用的规范（图2）。

本指南提供了用于评估批量纯化 mRNA 药物物质特性和放行测试的质量属性的方法，如表2建议使用以下表3中列出的方法来支持 LNP-mRNA 封装药物产品特性和放行测试的批量放行和稳定性测试。这些表格定义了药物物质和药物产品的质量概况以及方法选项。这些测试是示例，开发人员需要与卫生当局一起评估和决定适合给定产品的测试方法；可以根据具体情况选择替代方法、技术、设备和试剂。其中，稳定性指示参数可能包括 mRNA 数量、完整性、封装程度、效力、颗粒大小、多分散性和/或与 mRNA 和脂质成分相关的杂质。但请注意，必须根据经验，针对每种产品和相关阶段逐案评估和定义稳定性指示方法。