Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（Vero细胞） - undefined - 《药典三部

　　本品系用脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型减毒株分别接种于Vero细胞，经病毒培养、收获、浓缩、纯化、灭活、按比例混合后制成。用于预防脊髓灰质炎。

　　1 基本要求

　　生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

　　2 制造

　　2.1 生产用细胞

　　生产用细胞为Vero细胞。

　　2.1.1 细胞管理及检定

　　应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”规定。

　　每批原液的生产应来自复苏扩增后的同一细胞批。

　　各级细胞库代次应不超过批准的限定代次。

　　2.1.2 细胞制备

　　取工作细胞库中的细胞，经复苏、消化、置适宜温度下培养后，逐级放大，制备的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个细胞批。在反应器培养过程中对温度、溶氧浓度、pH值及搅拌速度等培养条件进行监控。

　　2.2 毒种

　　2.2.1 名称及来源

　　生产用毒种为脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株或Ⅲ型Sabin纯化株（Pfizer株）。毒株应来源于世界卫生组织（WHO）或其认定机构。

　　2.2.2 种子批的建立

　　应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理及质量控制”规定。

　　2.2.2.1 原始种子

　　Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒Sabin株及Pfizer株的原始毒种均由毒种研制者制备和保存。

　　2.2.2.2 主种子批和亚主种子批

　　主种子批Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒Sabin株的传代为SO+1，Ⅲ型病毒Pfizer株的传代水平为RSO1，均来源于WHO主种子库。可取主种子批毒种在Vero细胞上传一代制备的成分均一的一批病毒悬液称为亚主种子批。亚主种子批Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒Sabin株的传代水平为SO+2，Ⅲ型病毒Pfizer株的传代水平为RSO2。

　　2.2.2.3 工作种子批

　　取主种子或亚主种子批毒种在Vero细胞上传一代制备的成分均一的一批病毒悬液称为工作种子批。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒Sabin株工作种子批的传代水平为SO+3，Ⅲ型病毒Pfizer株传代水平不超过RSO3。

　　2.2.3 种子批毒种的检定

　　除另有规定外，工作种子批应进行以下全面检定。

　　2.2.3.1 鉴别试验

　　取适量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型单价脊髓灰质炎病毒特异性免疫血清与适量病毒供试品混合，置35℃～37.5℃中和2～3小时，接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置36℃±1℃培养，7天判定结果，病毒型别应准确无误；同时设血清和细胞对照，均应为阴性。病毒对照应为阳性。

　　2.2.3.2 病毒滴定

　　采用微量细胞病变法。取毒种做10倍系列稀释，取适宜的至少3个稀释度病毒液接种Hep-2细胞或其他敏感细胞，置36℃±1℃培养，7天判定结果。病毒滴度均应不低于6.5 lg CCID50/ml。应同时进行病毒参考品滴定。

　　2.2.3.3 无菌检查

　　依法检查（通则1101）（

（通则1101）），应符合规定。

　　2.2.3.4 分枝杆菌检查

　　以草分枝杆菌（CMCC 95024）或牛分枝杆菌菌株BCG作为阳性对照菌。取阳性对照菌接种于罗氏固体培养基，于37℃培养3～5天收集培养物，以0.85%～0.90%氯化钠溶液制成菌悬液，采用细菌浊度法确定菌含量，该菌液浊度与中国细菌浊度标准一致时活菌量约为2×107CFU/ml。稀释菌悬液，取不高于100CFU的菌液作为阳性对照。

　　供试品小于1ml时采用直接接种法，将供试品全部接种于适宜固体培养基（如罗氏培养基或Middlebrook 7H10培养基），每种培养基做3个重复；并同时设置阳性对照。将接种后的培养基置于37℃培养56天，阳性对照应有菌生长，接种供试品的培养基未见分枝杆菌生长，则判为合格。

　　供试品大于1ml时采用薄膜过滤法集菌后接种培养基。将供试品以0.22μm滤膜过滤后，取滤膜接种于适宜固体培养基，同时设阳性对照。所用培养基、培养时间及结果判定同上。

　　也可采用经过验证的分枝杆菌核酸检测法替代培养法。

　　2.2.3.5 支原体检查

　　依法检查（通则3301）（

（通则3301）），应符合规定。

　　2.2.3.6 外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302）（

（通则3302）），应符合规定。

　　2.2.3.7 家兔检查

　　经原代猴肾细胞制备毒种应做该项检查。

　　取体重为1.5～2.5kg的健康家兔至少5只，每只注射10ml，用其中1.0ml皮内多处注射，其余皮下注射，观察3周。到期时存活动物数应不低于80%，无B病毒和其他病毒感染判为合格。家兔在24小时以后死亡，疑有B病毒感染者应尸检，需留神经组织和脏器标本待查，用脑组织做10%悬液，用同样方法接种5只健康家兔进行检查，观察到期后动物应全部健存。

　　2.2.3.8 免疫原性检查

　　建立或变更主种子批（或亚主种子批）时应确认其免疫原性，必要时应根据药品注册管理的相关要求开展相应的临床试验。

　　2.2.3.9 猴体神经毒力试验

　　依法检查（通则3305）（

（通则3305）），应符合规定。

　　2.2.3.10 SV40核酸序列检查

　　依法检查（通则3304）（

（通则3304）），应为阴性。

　　2.2.3.11 Sabin株基因鉴定试验

　　采用基因测序或经批准的方法，测定毒株的VP1基因序列，应证明为Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒或Pfizer株Ⅲ型病毒。

　　2.2.4 毒种保存

　　液体毒种可加入终浓度为1mol/L的氯化镁溶液，置－60℃以下保存。

　　2.3 单价原液

　　2.3.1 细胞制备

　　按2.1.2项进行。

　　2.3.2 细胞培养液和维持液

　　采用适宜的培养液进行培养。如培养液含新生牛血清，其质量应符合要求（通则3604）（

（通则3604））。

　　维持液为不含新生牛血清的培养液。

　　2.3.3 对照细胞外源病毒因子检查

　　依法检查（通则3302）（

（通则3302）），应符合规定。

　　2.3.4 病毒接种、培养和收获

　　采用反应器培养细胞，接种毒种后继续培养，根据细胞病变情况进行收获，即为病毒收获物。病毒接种量及培养条件按批准的执行。

　　2.3.5 收获液检定

　　按3.1项进行。

　　2.3.6 病毒浓缩

　　收获液经过滤澄清后，进行超滤浓缩至适宜倍数。

　　2.3.7 病毒纯化

　　浓缩后的病毒液经凝胶过滤色谱处理或其他经批准的适宜方法收集病毒，再采用离子交换色谱进一步纯化病毒。

　　2.3.8 纯化液检定

　　按3.2项进行。

　　2.3.9 病毒灭活

　　纯化液灭活前应控制病毒液蛋白质浓度或D抗原浓度。纯化液经过滤后72小时内应加入甲醛溶液进行病毒灭活处理，甲醛浓度、灭活温度、灭活时间等条件按批准的执行。灭活过程中应适时进行再过滤处理。病毒液灭活至不超过全过程3/4时和灭活过程结束时，每个灭活容器分别取样，取样量至少含1500剂D抗原含量，取样后分别进行病毒灭活验证试验。灭活后的病毒液即为单价原液。

　　2.3.10 病毒灭活验证试验

　　采用细胞培养法进行病毒灭活验证。取至少含1500剂D抗原量的供试品接种Hep-2细胞或其他适宜的细胞，供试品与培养液之比不超过1∶4，每1ml供试品至少接种3cm2细胞单层，于35.5℃+1℃培养观察至规定时间（原代细胞至少培养3周）。至少留取1瓶细胞，作为试验对照细胞（只加细胞培养液）。接种供试品的每个容器的细胞培养物至少盲传2次，分别在更换培养液前（换液应不早于样品接种后5～7天）和观察结束时，取上述细胞培养上清液进行盲传接种，操作同前，培养物至少观察2周。初始细胞培养和2次盲传细胞培养均应无细胞病变发生。

　　观察结束后，应在初始细胞培养物上接种与单价病毒灭活液同型别的Sabin株病毒进行攻击，攻击病毒量应为接近检测限的低剂量病毒，攻击后的细胞应出现细胞病变。

　　为避免单价病毒灭活液中的甲醛对细胞培养的干扰，通常在供试品中加入亚硫酸氢钠进行中和，如中和后不能完全消除其毒性作用，可将供试品进行透析处理，但应保证透析后的供试品中至少含1500剂D抗原含量。

　　2.3.11 单价原液检定

　　按3.3项进行。

　　2.3.12 单价原液保存

　　于2～8℃保存，保存时间按批准的执行。

　　2.4 半成品

　　2.4.1 配制

　　按批准的抗原含量进行原液配制。可以加入适宜的抑菌剂，即为半成品。

　　2.4.2 半成品检定

　　按3.4项进行。

　　2.4.3 半成品保存

　　于2～8℃保存，保存时间按批准的执行。

　　2.5 成品

　　2.5.1 分批

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.2 分装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　2.5.3 规格

　　每瓶（支）0.5ml。每1人次用剂量为0.5ml，各型脊灰病毒D抗原含量按批准的执行。

　　2.5.4 包装

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定。

　　3 检定

　　3.1 收获液检定

　　3.1.1 无菌检查

　　依法检查（通则1101）（

（通则1101）），应符合规定。

　　3.1.2 支原体检查

　　依法检查（通则3301）（

（通则3301）），应符合规定。

　　3.1.3 病毒滴定

　　按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.5 lg CCID50/ml。

　　3.1.4 鉴别试验

　　按2.2.3.1项进行，病毒型别应准确无误。

　　3.2 纯化液检定

　　3.2.1 病毒滴定

　　按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于7.0 lg CCID50/ml。

　　3.2.2 鉴别试验

　　按2.2.3.1项进行，病毒型别应准确无误。

　　3.2.3 D抗原含量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）（

（通则3429）），经系列稀释的标准品和供试品与包被抗体反应后，加入检测抗体。反应结束后加入底物显色，测定吸光度值。以系列稀释的标准品D抗原浓度及其对应的吸光度值作标准曲线，样品吸收值与标准曲线比较而确定D抗原含量。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纯化液D抗原含量应符合批准的要求。

　　3.2.4 比活性测定

　　依法测定蛋白质含量（通则0731第二法（

通则0731第二法）），依据D抗原含量计算各型病毒纯化液比活性，应不低于10DU/μg蛋白质。

　　3.3 单价原液检定

　　3.3.1 无菌检查

　　依法检查（通则1101）（

（通则1101）），应符合规定。

　　3.3.2 D抗原含量

　　按3.2.3项进行，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型原液D抗原含量应符合批准的要求。

　　3.4 半成品检定

　　3.4.1 无菌检查

　　依法检查（通则1101）（

（通则1101）），应符合规定。

　　3.4.2 D抗原含量

　　按3.2.3项进行，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量应符合批准的要求。

　　3.4.3 大鼠效力试验

　　供试品各型ED50不显著低于参考疫苗（通则3534）（

（通则3534））。

　　3.5 成品检定

　　3.5.1 鉴别试验

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）（

（通则3429）），应证明含有脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原。

　　3.5.2 外观

　　应为橘红色、橘黄色澄明或无色澄明液体，无异物。

　　3.5.3 装量

　　依法检查（通则0102）（

（通则0102）），应不低于标示量。

　　3.5.4 pH值

　　应为6.5-7.5（通则0631）（

（通则0631））。

　　3.5.5 渗透压摩尔浓度

　　依法测定（通则0632）（

（通则0632）），应符合批准的要求。

　　3.5.6 2-苯氧乙醇含量

　　如添加2-苯氧乙醇，应采用高效液相色谱法（通则0512）（

（通则0512））或其他适宜方法测定，含量应为4.0～6.0mg/ml。

　　3.5.7 游离甲醛含量

　　应不高于30μg/剂（通则3207）（

（通则3207））。

　　3.5.8 蛋白质含量

　　应不高于10μg/剂（通则0731第二法（

通则0731第二法））。

　　3.5.9 D抗原含量

　　按3.2.3项进行，每剂量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原含量应符合批准的要求。

　　3.5.10 牛血清白蛋白残留量

　　应不高于50ng/剂（通则3411）（

（通则3411））。

　　3.5.11 抗生素残留量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）（

（通则3429）），应不高于50ng/剂。

　　3.5.12 Vero细胞DNA残留量

　　应不高于50pg/剂（通则3407第一法（

通则3407第一法））。

　　3.5.13 Vero细胞蛋白质残留量

　　采用酶联免疫吸附法（通则3429）（

（通则3429）），应不高于200ng/剂。

　　3.5.14 无菌检查

　　依法检查（通则1101）（

（通则1101）），应符合规定。

　　3.5.15 异常毒性检查

　　依法检查（通则1141）（

（通则1141）），应符合规定。

　　3.5.16 细菌内毒素检查

　　应小于10EU/剂（通则1143）（

（通则1143））。

　　4 保存、运输及有效期

　　于2～8℃避光保存和运输，避免冻结。自生产之日起，按批准的有效期执行。

　　5 使用说明

　　应符合“生物制品分包装及贮运管理”规定和批准的内容。