过氧化氢做为一种广谱的灭菌剂，过氧化氢气体在分解的过程中，会产生高活性的羟基自由基，因为过氧化氢是一个比较不稳定的物质，在正常的状态下就会在其内部发生微弱的电离反应，就可分离出氢离子和过氧化氢根，过氧化氢根又可以再次分解成氢离子和氧离子，在分解过程中会产生氢氧基离子，会有助于过氧化氢的电离反应，在分解的过程中是一个复杂的过程，体现在灭菌有效性上来说，氢氧自由基会破坏微生物的DNA/RNA，从而杀死微生物。
过氧化氢在极低的浓度下就能达到一个好的灭菌效果，约0.1mg/L（70PPM），那么我们怎么去验证现在使用的过氧化氢使用的这个浓度、时间能够符合我们的要求呢，这个是需要做一个充分的验证来证明灭菌效果。
验证前需要考虑我们所面临的环境，它会存在什么样的菌种，虽然过氧化氢有一个非常好的广谱的灭菌性，我们在做验证时都需要选择一个最差条件，使用最差的条件都能够杀灭的话，当我们再去面对一些比较容易杀灭的微生物时，就显得游刃有余了。所以验证时选择的生物指示剂的菌种相对于过氧化氢来说是选比较难杀灭的。目前对于过氧化氢来说，最难杀灭的菌种是芽孢类的，例如嗜热脂肪芽孢杆菌、梭状杆菌、枯草杆菌。还有一种是化学指示剂，通常用于灭菌程序开发阶段，需要判断灭菌效果，同时要去观察房间里过氧化氢的浓度分布，帮助我们进行灭菌程序的开发，通过化学指示卡的颜色的渐变的过程可以大概的了解到这个点与其它点的一个浓度和接触的时间，是不是满足我们的设定值，如果指示卡颜色变色不彻底，就可以知道，这点位虽然有过氧化氢接触，但它的量不足。指示卡变色程度有助于我们去修正过氧化氢的设置参数，包括灭菌设备的数量，避免在后期验证中的失败。
使用生物指示剂做为空间验证效果判断的依据，需要注意的是，我们在选择生物指示剂时不能用纤维材质或者纸质的生物指示剂做为载体，因为它是疏松多孔的，这种材质在气体灭菌的过程中是一个有利条件，它会很大量的吸附供体中的过氧化氢，假如灭菌过程中我们正常空气中的浓度只有100ppm，但是生物指示剂中可能会有200ppm甚至更多。这时候对于灭菌效果的判断是不利的。环境可能没有消毒完成，指示剂并没有很好的体现出来。根据验证所要覆盖最差条件的原理，过氧化氢蒸汽灭菌系统用的生物指示剂可以使用各种含有玻璃、金属或塑料和不透气载体系统，这种载体对于过氧化氢气体的吸附是非常小的，可以认为它是一个不利点，当它被完全杀灭时，可以证明指示剂外围的浓度肯定是符合的。
验证中指示剂布点原则，这是在验证过程中经常考虑的问题，需要把指示剂放到什么位置，布点原则在很多法规中有一些介绍，简单总结一下，虽然法规中没有明确要求放到什么位置、多少个，汇总下来就是跟我们的产品接触的设备表面的暴露区域是要放置的，人员需要经常操作和活动的区域也是一些比较危险的区域，这些区域也是需要放置的，像隔离器内部虽然没有人员直接接触操作，但也是一个风险点，是需要我们重点关注的位置。在整个房间布局的过程中要根据环境特点。过氧化氢气体是由设备产生的，再向周围扩散，所以过氧化氢的发生装置所在的位置与灭菌过程中房间最远的区域或最难到达的区域，设备底部或有遮档的区域，隐藏在门后的区域等，是一个最难/最后到达的地方。正常空间灭菌时，根据空调机组的划分来对区域进行灭菌的，单个空调机组控制的房间的最远端布点。并且在灭菌时，如果区域内有A级层流，它是一个内循环的过程，建议在灭菌过程中同时对A级层流进行灭菌，需要把A级层流开启，它会抽取空间中已经产生的过氧化氢，通过高效以后再排放出来。在以后的使用过程中会减少因为层流高效过滤器污染而产生的一些风险。对于一些层高很高的车间，有些生物制药的厂房层高很高达5米以上，在生物指示剂布点时要考虑立体布点，体现出高低点。还有一些物料传递的传递口外，如隧道烘箱的冷却区与B级灌装区之间的通道，这个位置建议在灭菌时做密封处理，这个地方透风会造成泄漏，产生局部灭菌不彻底问题。
需要进行空间灭菌的情况，对于新建的厂房首次使用前要对洁净区进行消毒，以后使用过程中定期进行空间灭菌，保证环境的无菌。根据生产情况制定一个灭菌周期，不同企业情况不同，根据生产的频率情况以及环境监测结果进行评估制定。还有在正常生产的过程中如果在日常环境监测情况下发现了一些难杀灭的霉菌或有一些异常情况导致环境补破坏，这时需要进行紧急的灭菌。
