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学习思考:端粒酶活性检测(PCR-Elisa法)

分享端粒酶活性检查的方法同时吐槽自己的质量研究心得。吐槽完轻装上阵。
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写在前面的话:进行端粒酶活性检测可间接考察细胞是否有成瘤的可能性。因为质量研究需要我们需要对我们的产品进行端粒酶活性检测,然而网络上的检测步骤五花八门,优秀的雷哥就结合某公司试剂盒梳理出了端粒酶活性检测的操作规程。以下是我这个老妈子学习时冒出来的稀奇古怪的念头,本文更多是我对质量研究过程的吐槽。欢迎拍砖。
1.检测原理
本法利用PCR-Elisa(聚合酶链式反应-酶联免疫)检测手段检测端粒酶活性,原理:
步骤1:延伸/扩增
第一步,端粒酶将端粒重复序列(TTAGGG)添加到生物素标记的合成P1-TS引物的3′端。使用引物P1-TS和锚定引物P2,通过PCR对这些延伸产物以及包含在相同反应容器中的内标(IS)进行扩增。来源于第一步中端粒酶介导的延伸产物的PCR产物含有端粒酶特异性六核苷酸增量,而内标(IS)产生216-bp的PCR产物。
步骤2:ELISA检测
将PCR产物分成两等份,变性,分别与地高辛-(DIG)标记的检测探针杂交,所述探针分别对端粒重复序列(P3-T)和内标(IS)(P3-Std), 具有特异性。通过生物素标记将所得产物固定到涂有链霉亲和素的微孔板上。然后用地高辛抗体检测固定的扩增子,该抗体与辣根过氧化物酶(抗DIG-HRP)和灵敏的过氧化物酶底物TMB缀合。
端粒酶活性检测(PCR-Elisa法)原理图(图片来源于网络,仅供学习交流用)
端粒酶活性检测(PCR-Elisa法)原理图(图片来源于网络,仅供学习交流用)

2.检验程序

2.1供试品细胞

2.1.1供试品取样应当具有代表性
产品、中间产品产生细胞悬液直接取得供试品细胞。
2.1.2细胞类制品原辅料的的检验数量及检验量
送检供试品细胞检验量不低于2.5×105细胞数量,注明细胞数量。每个供试品送检验数量以2或3为适宜。
2.1.3供试品处理及转移
供试品送检样本类型如为细胞悬液,常温条件下运输转移。
供试品送检样本类型如为细胞沉淀,使用1.5ml规格无菌离心管进行沉淀、转移。短暂存放4℃,冰上转移。长时间存放-80℃冷冻保存,干冰长途运输转移。

2.2对照细胞

2.2.1使用XXX细胞作为对照对照细胞1
2.2.2使用XXX细胞作为对照细胞2

2.3细胞样本处理

2.3.1供试品细胞沉淀获得
取一定数量(如,2×105个细胞)细胞悬液,3,000g,5min(2~8℃)离心获得沉淀。可-80℃保存细胞沉淀。
2.3.2供试品制备
冰上裂解细胞,加入样本裂解液(管序号1)至细胞浓度1×103细胞/μL,加入裂解液(如,200μL),裂解30min。16,000g,20min(2~8℃)离心,小心取上清175μL。(按照25μL/支分装,可-80℃保存备检。)
2.3.3供试品阴性对照制备
取制备的供试品分装样本1支,取20μL,加入2μL核糖核酸酶A(1mg/ml),37℃,20min。
或者使用加热灭活的方式直接制备供试品阴性对照。制备的供试品分装样本1支,85℃,10min。
吐槽1:最近莫名的烦躁,看见某些人输出的检验方法总让人火大。只考虑方法本身甚至就是黏贴说明书,很少思考检验的全过程。在质量研究早期缺少体系管理文件的当下,输出的方法不仅是要保证检验方法可行而且要考虑检验前和检验后,检验前需要确保工艺研究能便捷快速的提供需要的样本,检验后输出的数据又要考虑后续进行质量评价时数据可比等。
作为一个初入细胞质量行业做质量研究的小白,发现人的惰性很致命。因为有太多的未知,啥都是从零做起,此时才发现一个良好的习惯是多么的难能可贵。因为缺少明确指导所以更需要自己给自己加码加限制,不然一旦跑偏就无可救药。
吐槽2:除了检验本身,实验的设计也很重要。因为方法没有经过严格的验证,其次测试人员对方法的熟练度有限,因此质量研究过程需要做好实验设计。根据实验的需求增加阴性对照或阳性对照外,必要时增加质量控制溶液。除此以外还要考虑试剂盒的适用性。
以凝胶法内毒素检查为例,原本来说有了阳性对照和阴性对照加供试品阳性,这个实验是不是就完美了呢?有没有可能因为鲎试剂灵敏度过高导致测试结果偏高呢?不可能,因为我们鲎试剂做了灵敏度复核是满足要求的,及时有误差也是可以接受的。然而在质量研究早期因为人员有限试剂有限,很少进行专门的试剂验收。因此就需要首次使用时候增加必要的适用性试验。

2.4端粒酶活性检测——PCR

2.4.1配制PCR预混液,单个PCR反应:2×PCR反应液(管号2)25μL;216bp内参标准DNA (管号3)5μL。按照需要体积配制预混液,30μL/反应孔分装至PCR管,加入对应PCR样本模板。
2.4.2PCR样本(50μL/反应孔)
供试品1:
a1.供试品S1——3μL步骤2.3.2制备供试品等量3×10^3细胞裂解产物,补水17μL至总体积50μL。
b1.供试品阴性对照S1,0——与a1等量细胞裂解产物,补水至总体积50μL。
XXX对照细胞1:与供试品加样保持一致。
XXX细胞对照细胞2:与供试品加样保持一致。
阳性对照样本:
低浓度阳性对照:1μL低浓度阳性参比品(管序号4),1μL裂解液(管序号1),补水至总体积50μL。
高浓度阳性对照:1μL高浓度阳性参比品(管序号5),1μL裂解液(管序号1),补水至总体积50μL。
空白对照样本:1μL裂解液(管序号1),补水至总体积50μL。
2.4.3PCR程序
学习思考:端粒酶活性检测(PCR-Elisa法)
2.4.4获得PCR产物备检,进行Elisa实验。
吐槽3:做分子生物实验时候PCR管太小,很难标记。此时只能去做一些序号标记,这时候只靠脑子难免会出现意外。及时书写记录成了一个必备技能。也许要选择一个做质量研究的小伙伴,他不仅要善于思考还需要稳重踏实。一个高质量的质量研究员应该是自律的。
对于扩增后的产物个人总莫名的感觉恐惧,总会冒出来会不会有气溶胶等一类的担忧。然后为了缓解自己的焦虑,每次扩增完开盖前我都要进行一次离心,不然我心难安。

2.5端粒酶活性检测——Elisa

2.5.1储存液、工作液配制
①1×洗液:取10×洗液(管号10),使用无酶水稀释10倍即得
②抗体储存液:取辣根过氧化物标记绵阳抗体(管号11、120mU),加入240μL无酶水熔解至0.5U/mL
③抗体工作液:取抗体储存液②稀释50倍至10mU/mL,即得。注:临用现配。
2.5.2按照总反应数(测试样本×3),分装变性剂(管号7)10μL/支。
每个供试品需要3支变性剂,分别用于:供试品阴性对照S1,0;供试品检测S1;供试品内参照检测S1,IS。
iPSC对照细胞需要3支变性剂,同供试品。
空白对照需要1支变性剂,每个阳性对照需要2支变性剂。
2.5.3分别加入对应PCR产物2.5μL。混匀,室温放置10min。
2.5.4加入杂交液,充分混匀。
阴性对照样本、供试品检测、空白样本、阳性对照检测,加入杂交液T(管号8)100μL;
供试品内参照检测、阳性对照内参照检测,加入杂交液IS(管号9)100μL。
如示例:(成纤维细胞对照缩写Fi)
学习思考:端粒酶活性检测(PCR-Elisa法)
2.5.5杂交捕获
取混合液100μL至包被板孔中,封盖板膜。37℃孵育,摇床混匀(转速150~300rpm),2h。
2.5.6洗板3次
小心去除杂交液,每次使用1×洗液250μL,洗板3次,每次不低于30s。
2.5.7加入抗体孵育
加入抗体工作液(10mU/mL)100μL,封盖板膜,37℃孵育,摇床混匀(转速150~300rpm),2h。
2.5.8洗板5次
小心去除抗体工作液,每次使用1×洗液250μL,洗板5次,每次不低于30s。
2.5.9显色
加入100μL显色底液TMB(管号13),封盖板膜,避光,室温静置10~20min。10min时即可目测阳性结果呈现蓝色。
2.5.10终止显色
加入100μL显色终止液(管号14),终止反应,尽快使用酶标仪读取数据。
2.5.11读数
使用酶标仪读数,设置检测波长450nm,参比波长690nm。
2.5.12判读标准
阴性对照:通常检测值<0.1(A450,A690 )
阳性对照:低浓度阳性对照品通常检测值0.1~0.8(A450,A690 );高浓度阳性对照品通常检测值0.9~4.0(A450,A690 )
2.5.13供试品结果判断:
对比供试品样本与对照细胞1结果 。
对比供试品样本与对照细胞2结果。
吐槽4:没有质量标准是永远的痛,因为没有研究数据没有产品,最终的结论都无法确定。质量研究结束才会有最终的标准。作为一个质量研究人不得不再多看一些文献,再结合产品的用途等做出自己判断。除此以外,在结合相关的其他检验项目的结果来判断自己判断的合理性,抑或用不同原理的方法来验证自己的方法。苦逼的质量研究员,在不断的自我折磨中成长。

3.0材料和设备

3.1设备、耗材

3.1.1高速冷冻离心机
3.1.2金属浴
3.1.3PCR仪器
3.1.437℃恒温孵育混匀设备(如恒温震荡器、空气浴摇床)
3.1.5酶标仪
3.1.6各量程移液器及配套枪头、离心管、PCR管等常用耗材

3.2材料

3.2.1端粒酶活性检测试剂盒
3.2.2核糖核酸酶A
3.2.3诱导多能干细胞(iPSC细胞)
3.2.4成纤维细胞(HDFn细胞)

吐槽5:方法有了需要啥都的自己梳理清楚,然后需要啥买啥,抑或最大限度的利用当下资源开展质量研究,感觉自从做了质量研究自己就变成了讨吃的,天天管领导要这要那,四间空荡荡的房间填满了两间半,还有努力的余地。

4.结语
为了发泄我的抑郁,在平台胡言乱语一通,整理好心情进入下一站。质量研究人,不断地在自我挑战和被挑战中成长。


发布于 2022-11-08 21:32:40 © 著作权归作者所有