写在前面的话：该部分是进行LER评估必备的理论基础。个人认为该部分更多是索引，结合第8部分的案例进行理解和学习是必要的。该部分因为原理不清晰，简单理解即可，不需要深究。
4.0概述
(1)了解引起LER的可能分子作用机制有利于针对性的提出LER缓解策略，将在4.2项下进一步讨论；
(2)6.3节项下提出鲎试剂（LAL）的活性的可变性依赖于脂多糖分子一级结构和超级大分子结构的变化。此外不同测试方法（例如，LAL与MAT与RPT）测得的生物活性也不同。不同测试方法测试被LER影响样品，测试结果不同。LPS具有两亲性分子结构。在水环境中特定浓度的两亲LPS分子将会形成超级分子结构。其聚集状态依赖于形成聚集的分子的化学结构。LPS的聚集状态会对其生物活性造成影响。
(3)LER机制是基于以下假设提出的
① 细菌内毒素的超级分子机构发生改变会使其不易被检出（例如屏蔽）。
② 各种内毒素污染物以不同的化学形态存在，其中最强力（potent ）的化学形态含有2个D-葡萄糖构型己糖胺残基、2个磷酰基和6种脂肪酸，包括有确定链长和明确位置的3-酰基氧酰基。CSE和RSE等来源于革兰氏阴性菌（如大肠埃希菌）的LPS具有与此相同的结构。
③ 据报道，微生物的类型和多种环境因素均会影响LPS的化学性质及其超分子结构进而影响其遮蔽敏感性()。
碎碎念：主要是因为不同环境下类脂A的结构发生了改变
④ 解释存在LPS存在LER的两步机制被提出（二价阳离子螯合状态+聚集状态变化）；
⑤ CSE和RSE被证明对LER最敏感故被用作LER研究的LPS来源（碎碎念：最差条件）。
碎碎念：有人质疑CSE和RSE因为其纯度高而存在LER，第8部分研究证伪了该观点。
⑥ LER两步机制的理论基础是因为盐桥不稳定导致LER；但是对于具有其他取代基（如）氨基阿拉伯糖的细菌内毒素并不存在这种现象。
碎碎念：这是NOE同RSE和CSE不同的一点，这一点可以用于我们的LER研究评估。
(4)4.5节描述了一些LPS在特定制剂中存在LER而其他类型的LPS却不存在LER现象的潜在机制。（原文：Section 4.5 describes a potential mechanism by which some LPS exhibit LER in certain formulations and other types are less likely to do so）。保持时间研究中会因为用的LPS不同而出现不同的实验结果，因此了解这些区别是很重要的。LPS的超级分子机构发生改变（如聚集状态）可能导致C因子不能被激活进而导致使用LAL不能检出LPS。LPS会与多种基质形成聚集体。此外，细菌内毒素从可检出到不可检出的转变受温度和时间的影响采用光度测定法时实验设置和执行对实验结果的影响与加标样品组分组成对实验的影响是一样的。LPS的聚集状态的转变与溶液的平衡状态变化有关。在存在LER影响时细菌内毒素最终达成了新的平衡状态。
碎碎念：这里说到的各点对于我们评估有很大参考价值，我们需要根据我们的研究结果将这些不确定变成一定程度上是确定的。其次该部分强调的方法影响，我们需要考虑的就是正向研究还是反向研究。
(5)4.0章节探讨了LER潜在机制和作用方式。根据潜在的作用机制对LER研究案例（8.0章节）的实验结果差异进行了讨论。
明确LER的机制有利于更好的解释LER保持时间研究的结果，这也是提出消除LER或制定降低LER影响方案的基础。
4.1.LER和干扰因素的不同
(1)细菌内毒素干扰是指对鲎试剂酶联反应的抑制或者增强；这种对实验的干扰受pH、不均衡的离子浓度（
由于这些干扰存在浓度依赖性，可以通过稀释样品来消除干扰。
设置供试品阳性对照组（PPC）可以用于确认是否已消除干扰。如PPC的内毒素回收率为50%~200%之间则认为检测有效（干扰被消除）。
为确定最低有效稀释倍数需要对样品进行一系列的稀释，其中最低有效稀释倍数应小于等于MVD以确保产品检测的灵敏度。
传统的内毒素测试方法仍是必须的（ThisisthetraditionalBET approach and is stillrequired）。
(2)LER不受稀释过程影响具有时间依赖性（详见8.1-8.10）。LER现象通常受时间影响故在进行分析前需要将加标样品放置一段时间。
为排除可能的干扰因素需要采用验证的稀释方法进行加标样品的稀释。
在LER情况下，通常PPC仍是有效的，但是未经稀释样品却出现低回收率的情况，这事LER与经典干扰因素的不同。
如果存在LER现象，LER保持时间研究方案的设计将是至关重要的。
4.2.LER原因调查
研究表明在生物制品中存在LER现象，其中一些是含有高浓度蛋白质的产品（如单抗）或者是其处方中含有螯合剂和/或磷酸缓冲体系和聚山梨酯的产品等。如果特定产品存在LER现象，需要单独对其药物和安慰剂（不含药物的制剂）分别进行放置时间研究即可发现LER的组分
LER可能是由制剂某组分单独或者蛋白共同作用引起的（见研究案例8.2-8.10）。其也可能是由原料药自身引起的，如单克隆抗体（见方案8.1-8.8)。确定根本原因有利于理解LER的潜在机制和制定LER缓解策略。如确定是由处方原料引起的LER则应避免使用这些辅料或者优化处方。然而产品通常已经处于临床阶段或已经进行稳定性考察研究，通常不能进行以上改变。如不可避免的使用LER组分，建议采用缓解策略（见5.0节）。
碎碎念：这里透漏出一个信息LER研究越早解决方案越多，其次LER研究并不是要求必须在哪一阶段研究。但是我们需要注意我们进行研究后一定不能再出现影响LER的大改变，否则我们需要评估或补充研究。
4.3.LER两步反应模型
4.3.1.如4.2章节所述，LER现象可能是由制剂处方、组份或原料药本身引起。为研究LER开发的所有模型均应基于已知理化属性的基础上进行模型建立。
4.3.2.蛋白质与LPS的相互作用机制暂不明确，受蛋白质3D结构、疏水或亲电基团等影响。含有缓冲液或表面活性剂的典型处方会引起LER,这些信息均被用于LER机制的研究。例如含有螯合剂和非离子表面活性剂的处方已经被证实会引起LER，但是其存在其中某一组分（螯合剂或表面活性剂）时不太可能引起LER。
4.3.3.螯合剂（会与二价阳离子形成螯合物，如枸橼酸盐）和聚山梨酯（如聚山梨酯20和聚山梨酯80 ）常被用于保证蛋白质的结构稳定。因此对很有枸橼酸盐和聚山梨酯20的系统进行了LER研究（见8.3和8.4两节）。基于以上研究提出LER研究的分子模型，通过使用不同浓度的螯合剂进行研究表明LER是一个动态变化过程，遵循两步机制。
（LER遮蔽两步机制示意图，图片来源于PDA TR82，仅供学习交流用）
(1)第一步：将样品与螯合剂混合使LPS与二价阳离子（例如镁离子、钙离子）之间的盐桥不稳定，导致LPS聚集体状态被破坏；
(2)第二步：表面活性剂嵌入LPS之间导致LPS超分子聚集状态发生改变（如胶束、层状或六角状结构）。
(3)LPS的平衡状态发生了改变使的细菌内毒素不能被检测到，也就是内毒素被遮盖了（P-LPS）。图4.3.1模型仅为胶束模型，实际上可能会因疏水作用形成稳定的层状、六角形或倒置的立方结构。的研究证明表面活性剂表面残留的稳定受盐桥影响（Galanos has shown that the surface residues in particular are stabilized by salt bridges. ）。
4.3.4.LPS的稳定性受盐桥影响，会因螯合剂（如枸橼酸盐）和表面活性剂（例如聚山梨酯）的相互作用引起LER，但引起LER的物质不会局限于这些物质。其他影响LPS间的盐桥和改变LPS的聚集状态的分子会引起细菌内毒素遮蔽，如蛋白质。蛋白质与细菌内毒素的相互作用可以是亲水性的也可以是疏水性的，蛋白质会引起LPS的聚集状态改变。在这种情况下不需要存在缓冲液或表面活性剂即可引起LER。
4.3.5.无论是那种原因引起的遮蔽都表现为LER，在这个过程中LPS聚集状态都发生了改变。
LPS的结构是非常稳定的，只有在极端苛刻条件下才能破坏其结构（如大于250℃）。在某些情况下LPS会通过重建测试方法实现结构再造从而导致内毒素恢复其活性（见8.7节）。
在4.5节下对内毒素超级分子结构遮蔽的潜在机制进行了研究。这些研究只是初步结果受限于已知研究条件（如防止时间和温度、检测方法、样品的制备和混合、内毒素来源等LER的通用作用机制。
4.4.影响LER反应动力学的的因素（
与细菌内毒素增强/抑制干扰不同，LER是一种时间依赖现象，产品与内毒素比值远高于PPC分析（按最小有效稀释倍数稀释）[In contrast to BET inhibition/enhancement, LER is a time-dependent phenomenon, where the ratio of product to endotoxin is much higher than for PPC analysis, in which the diluted sample is spiked (minimal dilution of spiked endotoxin)]。
LPS由可检测到不可检测的原因可能是因为LPS的聚集状态发生了变化，而且可能会随时间变化。
LER现象可能会在几分钟内发生也可能需要几天甚至数月。在某些罕见情况下无法测定遮蔽动力学，因为LER遮蔽过程远快于细菌内毒素检查。
LPS超级分子转化率取决于转化状态相对于初始状态的能量差异。反应时间是温度和过度状态的函数（The reaction time is a function of the temperature and the relative transition state.通俗来说反应时间受温度和过渡状态影响）。通常启动一个化学反应需要活化能，如不是初始活化能不足，可以在后续过程中增加，例如可外在提供热能或机械能。样品的组成系统决定了过渡状态和活化能状态。
4.4.1.能量输入（外部）Energy Input (Extrinsic）
通过增加或减少能量的输入，可加速和降低动力学反应的速度（参见8.3和8.8）。在LER保持时间研究过程中可以通过改变孵育温度来提供外部能量（The input of energy can be manipulated by changing the incubation temperature (thermal energy) during an LER hold-time study）。LER保持时间研究
LER保持时间研究期间的温度（热能）。LER是一种时间依赖性动态变化的现象。在8.3节和8.8节研究证实在4 ℃下的动态反应时间长于25 ℃。LER是自发的，但受动力学因素限制，同时还有反应表面依赖性（）。这些变量受样品处理方式影响，例如涡旋。在对放置时间研究的样品进行加标后或在样品稀释前均需涡旋样品。涡旋时长和涡旋强度影响内毒素的掩蔽行为(43)。进一步的平行对比（ side-by-side comparison studie）研究表明，过度涡旋混合可显著增强LER效应(41)。实验设计可以明显地影响LER动力学反应过程。因此设计LER保持时间研究方案时需要考虑和控制这些参数（见第3.0节）。
4.4.2.样品的遮蔽能力Masking Capability of a Sample
如章节4.4所述，样品的掩蔽行为会受到外在因素的影响。内在因素（药物本身、处方中各组分的浓度、内毒素标准品中的填料）也决定了样品的掩蔽能力，反过来影响了反应动力学。对相似但组成略有不同的样品（例如：浓度、pH值等）进行的研究表明：相似但略有不同的样品（例如：浓度、pH值等）的LER的动力学可能存在很大差异（见第8.2、8.4、8.9节）
4.4.2.1.制剂组分FormulationComponents
蛋白质和（或）的各种组合。含有螯合剂和表面活性剂的缓冲系统已被证明会影响动力学(30)。
通过螯合引起的缓冲液具有二价金属离子如和Mg2 + 的缓冲液。结合二价离子使聚集体无法通过盐桥稳定。组氨酸缓冲液似乎不会引起（见8.12节），可能是因为其质子化与阳离子发生排斥反应，possibly becauseit reacts repulsively to cations in its protonated form。因此，二价阳离子与的相互作用越强，LER反应动力学越快。当LPS对螯合作用，对于LPS制剂处方中二价阳离子（LPS that is susceptible to the chelation effect, these effects would likely be exacerbated, less so for thoseLPS preparations in which divalent cations are less prominent ）：
EDTA > 枸橼酸盐> 磷酸盐 > 组氨酸
复合物的稳定性取决于样品值和螯合剂pKa。为此，在较高pH值下，形成通常更（见节）(30)。例如值为3的系统值为7.5的磷酸盐缓冲系统比更不容易引起LER。反过来，样品的值越高，由于反应动力学越快，越容易引起LER。
除了缓冲系统中的外，表面活性剂的存在会加剧。在生物制中聚山梨酯，其中最的是聚山梨酯和聚山梨酯80。聚山梨酯20比聚山梨酯80的动力学，因此引起的概率更大（见第8.3节）。事实上，与聚山梨酯80相比，聚山梨酯20不含不饱和脂肪酸且具有更高的扩散系数，这是该结果的解释。因此，聚山梨酯20和LPS之间，这是聚山梨酯20比聚山梨酯LER反应动力学更快的原因。
4.4.2.2.蛋白质Proteins
蛋白质（如单克隆抗体）的分子量约为，而表面活性剂的分子量约为1 kDa。分子量、电荷分布和疏水性。由于蛋白质以三维结构存在，只有表面暴露的残基和才能与相互作用，这使得预测与相互作用倾向很有挑战性。此外，蛋白质可以相互影响形成较高分子量的低聚物或多亚基复合物，进一步限制了蛋白质的可及表面。
阳离子蛋白（整体带正电荷）容易与结合，因为LPS其磷酸基团和带负电荷，与蛋白上带正电荷的相互。蛋白质上的疏水基团与LPS表面的脂质A通过相互作用。此外，蛋白质带负电荷的可能与二价阳离子形成复合物，进而引起L分子之间盐桥的不稳定。综上所述，没有经验数据，蛋白质和之间的机制相互作用显然更难预测。
由蛋白质组分掩蔽情况反应动力学受几个的影响。蛋白浓度可影响动力学；蛋白浓度越高，观察到掩蔽动力学越快（见第节）。在研究浓度掩蔽效应时，发现LER可能与蛋白浓度具有相关性。此外，蛋白质缓冲液组分和表面活性剂可引起。表面活性剂和LPS是两亲性的。因此，表面活性剂可以与LPS竞争结合蛋白质的疏水。因此，表面活性剂可以防止与蛋白结合，试验中的掩蔽。另外，表面活性剂与蛋白质的结合可以限制它们与LPS的相互作用引起掩蔽。因此，在某些情况下，通过存在表面活性剂和蛋白质组分将降至最低（见第节）。表面活性剂（生物制药产品的常见组分）的这种矛盾使得效应的可预测性具有挑战性。
4.4.3.内毒素遮蔽的敏感性Masking Susceptibility of Endotoxins
（1）尽管LPS具有共同的结构，但其以结构异质性而出名，结构差异会影响LPS生物活性(46)。结构多样性解释了为什么不同LPS标准物质在保持时间研究中显示回收率不同（见第8.3、8.10节）。例如，先前提出的两步反应机制局限于那些具有特定盐桥的LPS组分。在其他情况下，二价阳离子的功能被带电取代基取代。因此，螯合剂的存在可能不会破坏这些LPS标准物质的LPS–LPS相互作用的稳定性，螯合剂如柠檬酸盐不太可能降低LPS聚集物的刚性。同样，表面活性剂不太可能嵌入LPS分子之间。因此，含有正电荷取代基的修饰LPS分子会降低其LER的易感性。
当然，这种替换取决于细菌的种类和特定的生长条件。取代基可以附着在脂质A以及糖链的核心区域（图4.4.3-1），反过来影响LPS的结构。取代水平取决于内毒素的来源，这意味着取代基（例如，带正电荷氨基的加入）并不是均匀分布的（The level of substitution depends on the individual source of endotoxin, meaning that the substituents (e.g., addition of positively charged amino groups) may not necessarily be equally distributed.）。这解释了不同来源内毒素的掩蔽敏感性不同（见第8.3节）。
大肠埃希菌K-12和沙门菌中Kdo2-脂质A的共价修饰（图片来源于PDA TR82供参考）
（2）绘制LER效应的时间依赖性随温度变化的函数，可以得到阿伦尼乌斯相关，表明驱动掩蔽过程的动力学过程。再次考虑活化能模型(见4.4.1节)，带电取代基(如氨基阿拉伯糖)的取代增加了改变聚集态所需的能量。对不同来源内毒素掩蔽动力学的研究表明，掩蔽所需的能量大小各不相同(31)。由于保持时间研究的能量输入是由工艺和测试条件以及配方决定的，只有当使用容易被掩蔽的内毒素时，样品的掩蔽能力才能被评估
（3）可被螯合剂（如柠檬酸盐）与表面活性剂（如聚山梨酯20）结合掩盖的内毒素是LER敏感的（An endotoxin susceptible to LER is masked by a chelator, like citrate, in combination with a surfactant, like polysorbate 20）。这种内毒素的超分子结构由二价阳离子稳定。由大肠埃希菌的内毒素标准物质主要通过二价阳离子稳定其结构，易于发生LER，因此大肠埃希菌制备的内毒素标准物质是放置时间研究的推荐加标物。
4.5.可检测和不可检测细菌内毒素的潜在聚集状态Potential Aggregation States of Detectable and Non-detectable Endotoxin
自然界中不存在LPS单体而是因聚集体状态存在，这是由于脂质A分子之间的疏水相互作用引起的(24)。LPS分子之间形成额外的离子相互作用。此外，LPS分子是由各种各样类型的分子组成的混合物（ LPS molecules are a diverse mixture of molecular specie）。他们差异不仅在脂质A和核心区域，而且在分子量(MW)上也存在很大差异（由于其在O-抗原中的异质性）。因此，广泛的亲水-亲脂性平衡(HLB)分布可导致不同的超分子状态。这种异质性是可预测和众所周知的；例如，可以形成立方、层状和六角形结构(24)。从可检出转变为不可检出时LPS聚集状态（超分子结构）会发生变化。
因样品条件（即基质组分、离子强度、极性、pH值等）变化内毒素聚集体会存在不同的平衡状态。LPS聚合状态会影响其可检测性。例如，在不同的生产步骤（例如，分离、纯化、捕获、精制、过滤、化学修饰和结晶）中通常使用各种缓冲液。因此LPS存在不同的聚集平衡状态，不断改变内毒素的超分子结构，从而影响内毒素的可检测性。
（原文For example, a variety of buffers are commonly used during different manufacturing steps (e.g., isolation, purification, capture, polishing, filtration, chemical modification, and crystallization). Thus, there are situations where a new equilibrium state is established, a changed supramolecular structure of endotoxin that impacts endotoxin detectability.）
为了逆转LER效应，需将内毒素超分子的平衡态改变为可检测状态。样品的平衡态受到多种因素的影响。生产工艺早期一些因素会影响LPS的平衡状态，例如缓冲液或温度的变化，可能会引起从不可检出至可检出内毒素的自发变化。
为了提高检测效率，除了被动操作外，还可以通过对样品处理进行主动操作来进行检测。这个过程称为揭盲（demasking）。在这种情况下，调整样品条件以便内毒素再次处于可检出状态（参见章节8.7）。由于样品条件（pH值、离子强度、蛋白质含量等）因样品基质而异，因此没有通用的揭盲处理方法。必须根据不同样品制定和调整检测方案。消除LER的一些缓解策略详见5.0节。
4.5.1.限制LPS与C因子相互作用和LER
为了进一步了解基于鲎试剂中C因子与被遮蔽内毒素的相互作用的限制因素，需要了解结构-功能关系(47，48)。最有可能的机制是内毒素的超分子结构发生了改变。目前尚不清楚负责激活C因子的LPS的确切超分子结构，部分原因是由于异质性现象和缺乏相应分析方法。然而，当LPS被掩盖时（如：未被LAL检测到，未被因子C识别），假定其核心化学结构仍存在于样品中。
在存在表面活性剂（如洗涤剂或蛋白质）的情况下内毒素的状态改变（内毒素状态从高级结构变为单体结构）是可预期的。电子显微镜数据显示使用洗涤剂脱氧胆酸盐可使LPS分离的研究支持这一观点(49)。此外，Kobayashi等人假设Triton X-100在LPS存在的情况下干扰因子C的活性(50)。这种非离子洗涤剂可能影响LPS的超分子结构。此外，在保持时间研究中，相对于LPS制剂中使用的表面活性剂摩尔浓度可能过高（ Moreover, surfactant concentrations used in regular formulations are likely present in molar excess relative to LPS in hold-time studies. ）。在这种情况下，LPS的脂质A部分可能嵌入胶束中使得溶液不可及（个人理解：脂质A无法被检测到）。LPS被解除聚集状态后其脂质A部分因空间位阻原因不能结合鲎试剂中的因子C导致使用鲎试剂检测不到内毒素。聚集状态的另一个可能的改变可能是只有聚集的表面LPS分子被表面活性剂取代。聚集体的“内部”因为二价阳离子不能从内部被去除所以内部LPS聚集状态没有改变（即使通过电渗析的方式也很难去除所有二价阳离子）(51)。螯合剂可能无法去除LPS聚集体中的所有二价阳离子，因为一些阳离子可能保留在LPS聚集体的内部。在这种情况下，用去污剂分子替换LPS聚集体表面的LPS分子可降低LPS活性。在某些情况下，低水平的非离子表面活性剂甚至显示可避免加标RSE的样本发生LER（见第8.9节）。然而，从多聚体LPS的存在到单个LPS分子与因子C相互作用的最终反应途径仍不清楚。
4.5.2.单体和聚集体LPS活性
因为已发表刊物中观点是矛盾的，是单体LPS还是聚集的LPS代表了LPS的活性状态这一问题目前是极具挑战的。一个论点提出以单体内毒素为活性表现形式，其直接与生物受体相互作用(52-54)。相反的论点认为，只有超分子、更高序列的内毒素代表内毒素的活性形式(22,24,55)。这也是合理的，因为LPS是一种两亲性分子，主要以其聚集形式存在。
由于文献观点不一致，LPS的LAL可检测或生物学活性可能由其单体结构还是超分子结构决定都是可能的。；尽管按热力学理论在水环境中游离的LPS单体是不可能存在的。在这种情况下，单体的分子结构和制剂配方将影响决定LPS活性的超分子结构。这样，脂质A的可及性是由LPS的核心结构和聚集状态决定的。
因此，LPS的聚集状态起着重要作用，许多表征方法（characterization method），包括NMR、cryo-TEM和DLS已被应用(24，29，56，57)。然而，难以解释哪些结构负责与C因子结合和影响LAL活性。聚集状态也具有浓度依赖性，用于结构分析的内毒素浓度主要在微摩尔范围内。相比之下，LAL方法灵敏度更高在皮摩尔至飞摩尔范围内。因此，表征方法很可能不能反映用于LER研究的LAL方法中存在的实际LPS结构。尽管具有挑战性，但了解内毒素的活性状态对于更全面地了解内毒素检测和LER现象是必要的。
4.6.总结
4.0节介绍了关于各种条件下LPS涉及的一些机制因素的当前识，并描述了如何区分试验干扰和LER现象。因为在药典中，制剂（或其他样品类型）的稀释液加标，在研究未稀释的产品加标，在规定温度下放置通常为数天更不可能改变因此，在hold time研究中，在细菌内毒素检查稀释溶液中加标获取的回收率（即）可能不如在未稀释产品中加标内毒素回收率有效。
试图解释为什么螯合剂和表面活性剂的组合可以引起，也可能是的一个合理的机制。以相同方式的和CSE具有这些结构，这可能与通过其他方式内毒素相比，其更可能表现出的原因。来源于其他微生物或采用替代生长条件（培养基、盐等）制备的内毒素对的敏感性较低。对LER的易感性是这两种来源的最差情况”条件的一个原因。
4.0节为什么某些内毒素在产品制剂中更容易发生的基础节描述了如何将该知识作为解决LER的潜在方法
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