写在前面的话：前面两部分的翻译不是很顺畅，所以后面的翻译不再拘泥于原文，尽量以清单体的方式展示各部分内容。对于重点部分英文原文附录在后面便于阅读。
1.概述
（图片来源于网络，仅供参考，枸橼酸中不同来源内毒素LER hold-time研究图）
1.1.LER hold-time研究不是药典方法适用性试验的一部分，被视作强制性的补充研究；
1.2.实验设计、实验流程和使用的内毒素种类等都会影响LER hold-time研究的结果；
1.3.进行LER研究首先要做到良好的细菌内毒素检查实践的前提下进行；
碎碎念：至少进行了一个厂家鲎试剂的干扰实验后进行，不然无法排除方法的影响；其次选择回收率≥70%的。
1.4.本章节主要讲LER Hold-time研究需要考虑的重点；
1.5.如有充分理由可以使用替代方法；
1.6.进行LER Hold-time研究的方案必须经过质量管理部门批准，必须包括(清晰且明确的接受标准)。
1.7.进行LER Hold-time研究必要时需要进行探究性研究，前期研究试验可以不经过质量管理部门批准。
1.8.QC样品的存放时间验证（从取样到检测之间的最大允许时间）并不在本技术报告研究范围以内。其中本报告给出的很多原则（特别是4.1.2节）也适用于QC样品的存放时间验证。将LER Hold-time研究和QC样品存储时间分开的原因如下
① LER保持时间研究是确定在生产工艺条件下是否存在LER现象；对于注射剂来说生产工艺是以将药液灌装至最终容器（如西林瓶或预充针）作为结束。
② QC样品存储时间涉及所有需要满足GMP要求的所有样品类型；LER测试主要是针对针对药物制剂和BLAs（11.18.19）
③ 原则上QC样品的存储条件可以跟生产条件不同（例如：样品可以在测试前进行稀释或者冷冻）
2.实验方法
2.1.进行LER保持时间研究的细菌内毒素检查方法必须和样品例行检查的测试方法一致
① 鲎试剂供应商；
② 内毒素标准供应商；
③ 供试液制备过程和鲎试剂的复溶方式（例如：测试前样品的储存方式是冷藏还是冷冻、样品的涡旋时间和速度、样品稀释方案、稀释用试管等）；
碎碎念：特别注意稀释方案相同是指样品稀释全过程相同，包括初始取样量、稀释次数等均一致。
④ 数据分析方法（注意：LER研究的回收率和日常检查的回收率不是一个完全相同的概念)
⑤ 样品最大稀释倍数不得超过MVD；
⑥ 如果低稀释倍数不能有效开展LER保持时间研究，可以采用不超过MVD经验证
2.2.试剂和材料
① 试验所用耗材必须来源于合格供应商；
② 每批鲎试剂使用前都必须进行标准曲线可靠性试验；
③ 细菌内毒素检查用水、实验用耗材和所有缓冲溶液都必须不得检出内毒素。
2.3.LER研究用加标样品的制备
2.3.1.应使用制剂原样品进行研究，如是冻干制剂需要根据产品使用说明复溶后作为待研究样品；
2.3.2.首选CSE或RSE作为参考品进行加标（碎碎念：被认为是最差条件），可使用环境内毒素（NOE）做支持性研究；
2.3.3.必要时可以选择额外的样品加标用于调查；
2.3.4.如实验失败，应对原样品和额外样品均进行测试；
2.3.5.用于加标的内毒素标准溶液的体积应不大于待加标溶液总体积的10%（如取1mL50EU/mL的内毒素标准溶液加至9mL的样品中可得到10mL的含5EU/mL的质控内毒素溶液的加标样品）。
2.3.6.如采用光度测定法进行研究，加标后的样品按经验证的稀释倍数稀释后加标内毒素的浓度应在标准曲线中点附近（落在标准曲线范围以外无法计算，近中点误差较小）。原文：The spiking level should account for validated sample dilution and midpoint of the standard curve for testing if the study is going to be performed using a kinetic method (a spiking level of 5 EU/mL is a realistic value to detect LER)
示例：
① Undilutedsampleisspikedtoafinalconcentrationof5EU/mL
未稀释样品最终浓度为
② BET method: Kinetic chromogenicassay
细菌内毒素检查方法：动态显色法
③ Validated sample dilution for theBET: 1:50
经验证的：：50
④ Four-pointstandardcurve(0.005,0.05,0.5,and5.0EU/mL)
四点标准曲线（0.005、0.05、0.5和5.0 EU/mL）
⑤ Levelofspikedendotoxinin1:50dilutedsample:0.1EU/mL
稀释50倍后样品中的细菌内毒素水平为：0.1EU/mL
⑥ Conclusion:
结论：完全在标准曲线范围内
建议采用多等份方法，以避免从单个容器中重复采样（见第8.5节）。其中有两种方法：可对大量样品进行加标后按时间点样品等分，适当储存，然后在规定时间点进行测定。
Charles River培训课件，仅供学习交流用为了进行反向测定方法，可以制备等分试样并以反向时间方式加标内毒素；例如，第7天样品首先加标，第0天样品最后加标。所有时间点样品均在同一时间进行分析。
碎碎念：注意两种方法的优缺点，结合实际条件和方法特点进行选择如果分析方法回收率高且稳健可以选择正向研究；如担心方法干扰选择反向研究。如一次检验量有限选择正向研究；进行反向研究时特别注意保证加标量一致等。
2.3.7.如采用凝胶法进行研究加标后的内毒素按验证稀释倍数稀释后的内毒素含量应在预设值的50%~200%之间。
2.4.储存容器
使用对内毒素无吸附无干扰的容器进行LER保持时间研究。
2.5.批次要求
① 为了确保测试结果具有代表性且能反映出批次间差异性，需要从三个批次中取样。
② 各公司和实验室应根据产品的批量、处方和其他相关因素确定适当的批次数量进行LER保持时间研究。
2.6.储存温度和时间
（单抗的生产流程图，图片来源于网络，仅供参考）
2.6.1.应在工艺相关温度和时间下进行LER研究；其中工艺相关是指最可能引起LER现象的相关工艺步骤（如加入聚山梨酯和螯合剂、放置时间、工艺过程中与外界联通打开或关闭操作）。
2.6.2.为确保不同测试之间的可比性和保证研究顺利进行，尽管不同的工艺步骤在不同的温度和时间下进行，但是进行LER研究的温度还是归类为以下三种：
① 如相关工艺步骤在冷藏条件下进行的，LER研究应在2~8℃条件下进行7天的研究；
② 如相关工艺步骤在室温下进行的，则应在20~25℃条件下进行研究，应基于风险评估确定研究时间（参见章节3.1.5.1，本稿2.6.3）；
③ 如相关工艺步骤中部分在冷藏条件下进行，剩余部分在室温条件下进行，则应在20~25℃条件下进行研究，通过风险评估确定研究时间（参见章节3.1.5.1，，本稿2.6.3)；
④ 如hold-time研究时产生的结果不明确（）或需要增加额外信息，可以增加更多的时间点来进行hold-time研究。
2.6.3.LER保持时间研究温度和时间确定的风险评估示例（原文3.1.5.1）
该示例是对一个假设生产工艺进行的风险评估，评估内容包括：如何确定与LER有关的关键步骤和如何确定LER研究的温度和时间（参考下表）。
各公司的生产和QC主题专家（）应结合本公司产品生产工艺进行相似的风险评估来确定相关工艺的温度和时间用于支持LER hold-time研究。
① 以上示例有三个步骤与LER有关；
② 如工艺条件既存在2~8℃和室温两种工艺条件，应在20~25℃条件下进行LER hold-time研究；
③ 在示例中应在相关工艺步骤和保持时间总时长作为LER hold-time研究时长（工艺步骤2+工艺步骤4=5小时+30小时=35小时）。不考虑工艺步骤3，LER现象可以在室温下可被检出（CSE或RSE被用作是最差条件分析）
原文：In this example, the LER hold-time study should be conducted at room temperature for the combined longest process- and hold-times(Process step #2 + Process step #4 = 5 hours plus 30 hours = 35 hours). Process step #3 is not considered because LER would be detected during the room temperature hold-time study (CSE/RSE is used as a worst-case analyte).
2.7.质量控制样品（Controls）
取细菌内毒素检查用水代替供试品加入同浓度的细菌内毒素，在相同容器内与加标供试品检验同法平行操作（加入相同量的内毒素、稀释步骤一致）。
碎碎念：区别于阳性对照，它也是要进行hold-time研究的。主要是反应内毒素在研究过程中的变化。
2.8.设备
进行LER保持时间研究的设备需要与日常进行细菌内毒素检查的设备相当（
2.9.人员
LER研究人员必须具备细菌内毒素检查资质且你能够执行（）LER研究方案。
（再次认识一下内毒素，图片来源于网络仅供参考）
2.10.数据分析和说明
2.10.1.通过对比加标供试品和质量控制样品种的细菌内毒素，通过计算内毒素的回收率来确认是否存在LER现象。
原文：To determine if LER is present, the endotoxin recovery is calculated by comparing the amount of endotoxin in the sample against the amount of endotoxin in the LRW reference sample.
2.10.2.为得到准确且有效的结果，至少需要进行四个时间点的研究。当两个连续的时间点的回收率均低于50%时证明存在LER现象。如果仅有最后一个时间点的回收率低于50%，为确保研究结果准确则需要增加额外的时间点用于确认是否存在LER内毒素屏蔽。
原文：A minimum offour time-points must be conducted to ensure valid and accurate results. Two consecutive data points falling below 50% recovery indicates LER. If the last time-point results in a recovery of less than 50%, additional time-points should be tested to aid in the analysis of LER endotoxinmasking and to ensure that the LER result is accurate。
碎碎念：在中间一个点低于50%其他各点均高于50%时，个人认为通常可以认为不存在LER。为什么呢？
2.10.3.需对每批数据进行单独绘图和分析，不得取总的平均值用于分析。每一批均应单独判断是否复核接受标准。如任何一批出现不符合要求（例如：回收率低于50%），则认为产品或者生产工艺中存在干扰因素影响细菌内毒素的回收。不应将样品“”（零时）的细菌内毒素测试结果作为参考标准，因为LER现象可能会在几分钟内就会发生，如以零时细菌内毒素测试结果作为参考标准会导致较大偏差。
原文：Data from all batches must be plotted and interpreted separately; no averaging for the mean is allowed. Each of the batches must independently fulfill the acceptance criteria. If any batch has aconfirmed failure。
思考：内毒素加入样品混合后就可能会出现LER现象，所以不能以零时的加标样品作为初始值，初始值可以使用水代替供试品进行研究。
疑问：加标样品进行检测时候是否还需要做供试品阳性组呢？
2.10.4.2~8℃研究
2~8℃条件下进行研究时，如使用高浓度的细菌内毒素溶液作为被分析物则应根据LRW对照品来计算回收率（我认为是2.7的质量控制样品）。
① 根本原因：高浓度细菌内毒素标准品的测试报告中的数值不准确，且将其经多步稀释达到适宜浓度的过程会引入误差。
② 可使用CSE作为参考因为其检验报告中的内毒素效价是准确的。CSE通常不需要稀释或仅需很好的试验步骤即可达到适宜的浓度，这样就减少了引入误差的可能。使用CSE时可以使用其理论值作为计算回收率的参考。
碎碎念：不是高浓度可以使用CSE的理论值作为参考。
2.10.5.20~25℃研究
再20~25℃条件下进行LER保持时间研究，需要通过与加标细菌内毒素水溶液对比来计算回收率（参见4.1.6），因为细菌内毒素浓度再室温下（20~25℃）存储时会随时间延长而降低。
根本原因（Rationale）: Only limited data on endotoxin storage at room temperature are available.
在室温下存储时仅有部分内毒素检测数据可用。
其他章节链接：
