写在前面的话：
包装系统密封性的评估应考虑包装的类型、材料/组件和密封机理等，根据产品自身特点、生产工艺和药品生命周期的不同阶段，结合检查方法的灵敏度和适用性等，基于风险
因网络上已有特别多的总结和类似文章，故本文第一部分是相关法规的总结，第二部分是个人的理解及实操的经验和个人认可的网络上知识的汇总思维导图，但三部分是郭涤亮等老师对《美国药典》〈1207〉无菌药品包装系统密封性评估的介绍与解读的思维导图。
一、微生物挑战法相关的那些法规
专门关于微生物挑战法的法规并不多，下面总结的法规主要是容器密封完整性相关的所有法规。其中GMP指南里面的实例、美国药典1207、PDA TR 27、PDA TR86关于微生物挑战法的描述较多。
二、微生物挑战法实操经验分享
1.关于微生物挑战法的实验设计考量
关于微生物菌种的选择
基本原则是选择尽可能小而易动和环境中常见的菌。其中大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、缺陷假单胞菌（现在改名叫缺陷短波单胞菌）、粘质沙雷氏菌等都有被推荐。个人比较中意粘质沙雷氏菌。不仅是因为粘质沙雷氏菌的菌液红色很均匀，也基于个人以为其他微生物存在或多或少的缺点：大肠埃希菌是否会在培养过程中变异为大肠菌群、铜绿假单胞菌培养过程产生的絮状物是否会堵孔、缺陷假单胞菌名字里的缺陷二字总让我心生畏惧（开玩笑的）。
关于菌液浓度的考虑
为了更准确的判定检测灵敏度和减少误判，菌液浓度似乎是越大越好，有些老师建议对菌液浓度进行验证，个人以为这太难为人了。我们的做法是确定菌液浓度的时候多取几个点，而不是随机移取少量菌液进行计数就作为最终的菌液浓度结果。
为了便于菌液的活性和均匀性，进行复苏然后再增菌的方式好过直接使用母代进行增菌；其次在配制培养基时我们用的大蓝盖瓶，确保实验前可以轻轻混匀（强迫症的选择）；
最后强调一下选择对数期的菌液，进入稳定期和衰亡期的菌液的侵染能力是不足的。
关于培养基的选择
培养基通常就是胰酪大豆胨液体培养基，需要注意的其促生长实验要包括我们使用的挑战菌，不是适用性检查合格就可以用了。具体其他的要求见后面的思维导图。
适用性检查的时候培养基的装载方式建议和挑战时的方式一致，特别是厌氧菌的培养基适用性检查时；
补充一点就是硫乙醇酸盐流体培养基可以用于厌氧菌的培养，需要注意灭菌后不能有琼脂析出，不然可能会堵孔，也可以考虑使用不含琼脂的硫乙醇酸盐流体培养基进行试验。
关于试验条件的考量首先要说设备的选择，我们选择的是脉动真空灭菌柜，踩的坑有以下两个：1.第一次没有提前断开夹层蒸汽，导致整个柜体温度高，拿水降温折腾了好久才给降下来；2.手动降压没有证据，后面使用泄漏程序作为控制方式又出现泄露测试不通过的问题，泄露测试的接收限值需要改一下，再就是可以适当稍高一些。以下为我们压强评估的考量，供参考。
根据ASTM D6653/6653M-13 Standard Test Methods forDetermining the Effects of High Altitude on packaging Systems By Vacuum Method.（压力换算表见下图）及产品自身条件确认压力条件为-50kPa→ 常压。
需要做到无菌操作是必需的，对于可灭菌的物品进行灭菌时必要的，如果不能灭菌可以考虑使用过氧乙酸和异丙醇的混合溶液进行处理。需要特别注意阳性样品不能灭菌灭菌后会出现孔径变化或堵塞等问题，其次压强也会变化。这些跟不能灌装后灭菌时一个道理。
灌装后的阳性样品不能导致或者倾斜，5μm的都会轻微渗漏，为什么都懂了。
其次阳性样品毕竟带孔，我们在无菌灌装后就在层流下把它们放在无菌支架上后放在预先准备后的已灭菌的灭菌指示袋里面（有那么大孔我总担心他会被污染），侵入后我们也采取了类似的措施。
关于阳性样品的制备
每种制备方法都有其优缺点，我们需要注意选择适宜的方法，具体看思维导图。
关于侵入实验过程
这个过程很简单，但是前期准备很重要，特别是用到的器具都要提前无菌处理。
其次侵入过程注意阳性孔的位置不要贴壁等就是不要被堵孔；
再就是注意侵入时的温度和压强控制等；需要避免菌液溢出；
建议提前准备好支架保证各样品被妥善放置；
建议提前计划，这样我想起那个自费的不锈钢托盘真心疼（我的钱啊）。
关于侵入后的清洁消毒
侵入结束后对样品表面进行清洁消毒是必要的，个人建议注意规避阳性孔，其次使用的抹布不能脱丝且消毒剂含量不能过多，就是满足一个目的不要因为清洁消毒造成假阴性或者假阳性。
关于挑战结束后的促生长
培养结束后培养基我们进行了营养试验，我们的考虑是确认其培养结束应满足要求，有点内卷，请见谅。
关于鉴定的考量
作为一个懒人我真的不想全部进行鉴定，这也是我喜欢粘质沙雷菌的一个原因，形态特征很明显，辨识度高，有成为明星的潜质，再就是假设哪天想中美双报了，我也不用补充验证。
回归正题，我们先进行形态学鉴定，然后进行部分阳性菌的API鉴定的。
微生物挑战法流程图分享
上图来源于研如玉公众号的【密封性实战研究】包材密封性微生物挑战法之我见
2.关于微生物挑战法的思维导图
前面是我们的实操经验，在进行方案设计前，我们查阅了很多资料看了很多文章，具体总结看下图。
3.关于微生物挑战法的灵敏度的确定
这个点我们选择是100%侵入的最小孔径作为灵敏度的，来源呢是某药检所老师的分享。
除此以外PDA TR86有明确的阐述，具体解读资源见传送门：PDA最新报告TR86对CCIT研究MALL值计算的建议 - 博普智库 (bopuyun.com)
三、《美国药典》〈1207〉无菌药品包装系统密封性评估的介绍与解读
在中国国情决定，考官的讲解更受欢迎，因此个人不废话直接上思维导图了。上图前废话一句：为什么不附上原文的原因是原文文字太多，为了便于各位大大参阅，个人将知识点按个人理解进行了适量删减。
四 参考文献
1.《化学药品注射剂包装系统密封性研究技术指南（征求意见稿）》
2.FDA <Guidance for Industry: Container and Closure System Integrity Testing in Lieu of Sterility Testing as a Component of the Stability Protocol for Sterile Products>（2008）
3. FDA. Guidance for Industry - Container Closure Systems for Packaging Human Drugs and Biologics (Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation). 1999.
4.郭涤亮,董武军,马骏威,王璐,李中杰.《美国药典》〈1207〉无菌药品包装系统密封性评估的介绍与解读[J].中国新药杂志,2021,30(10):880-885.
五结语
第一次进行经验分享，恳请大家提出宝贵建议。花费了8个小时完成这份小结，没有功劳也有苦劳，麻烦大家给点个免费的赞（据说赞多了给钱）。如果值得请分享给需要的人，送人玫瑰手留余香。
