一、热对活细胞的作用
热力灭菌是研究最深、使用最广的灭菌方式。当温度超过细胞最佳生理活动的温度范围时，随着温度的升高，细胞代谢减缓，细胞的生长及繁殖最终停止。每种细胞的生理活动的温度均有一上限，一旦温度超过它的上限，起生命作用的蛋白质、酶及核酸会被永久性破坏，从而导致细胞发生不可逆转的死亡。
从微观上看，不具备真正核膜结构的原核细胞(如细菌和蓝绿藻)耐热性最强。某些嗜热性细菌甚至可在80℃以上的高温中存活。但是，绝大多数生长态菌在80～100℃下即可被迅速杀灭。具备核膜结构的真核微生物，如真菌和原生动物，在60～80℃下就可被迅速杀灭。多数病毒的耐热较差，只有乙肝病毒(HBV)例外，它要在75℃下至少曝热3min 才能被灭活。
还有一些其他类型的生物体也具有较强的耐热性。例如，痉挛性假麻痹症①的蛋白侵袭子(Prion)病原体，它既不属细胞型微生物也不属病毒，需要在132℃下加热1h 才可完全杀灭；而在细菌中，需氧菌中的芽孢杆菌属(Bacillus)和厌氧菌中的梭状芽孢杆菌属 (Clostridium)，也具有较强的耐热性。这些细菌的细胞能产生内源性孢子(芽孢)或胞间休眠体，一旦形成这
种状态，它们对热、干燥及化学消毒剂的耐受性增强。要想杀灭这类芽孢，使之下降一个数量级(对数单位)，干热灭菌的温度必须达到100～170℃，湿热灭菌的温度在80～129℃之间。如以干热灭菌及湿热灭菌的灭菌率L(Lethality)来计算，芽孢被杀灭困难的程度比其生长态时增大了104～105 倍。
细菌芽孢的耐热性与多种因素有关，有些因素尚没被人们完全认识。芽孢形成时，细菌停止生化反应，并将遗传物质包藏在芽孢中。此过程中发生了一系列生理变化：细胞质大量脱水，体积变小，在变小的原生质体周围形成了一层厚壳，此过程中，还生成了一种特殊化学物质——吡啶二羧酸或DPA(吡啶—2，6—二羧酸)。在芽孢形成阶段，吡啶二羧酸钙能与
脱氧核糖核酸(DNA)以及细胞内的酶形成复合物，从而对休眠状态的芽孢起保护作用。处于休眠状态的芽孢可以存活很多年，在适宜的条件下，它们在数分钟内复活。
二、影响灭菌效果的因素
1．物理／化学条件
在细菌形成芽孢过程中的多种环境因素会影响孢子的耐热性。例如，温度较高并有二价阳离子(如Ca2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+)存在时，芽孢的耐热性增强；与此相反，当pH 超出6.0～8.0 的范围时，或在高浓度的盐水或磷酸盐中形成芽孢时，其耐热性下降。
自然界中芽孢的耐热性与环境条件相关，如溶液浓度、水分(相对平衡湿度aw)、pH、对芽孢有损伤作用的物理因素以及对芽孢有抑制作用的化学品等，它们均会影响芽孢的耐热性。
包藏在晶体或有机物内的芽孢，其耐热性通常明显高于一般非包藏态的芽孢。因此，在某一温度条件下，将泥土包藏性芽孢和从泥土分离并培养得到的芽孢同时灭菌时，要想获得相同的灭菌效果，同一灭菌温度下，前者所需的灭菌时间比后者要高出十多倍。由于被灭菌品受到了泥土中芽孢的污染，如在运输处理中被未经过滤空气微粒所致的污染，或者由人员或其他物品接触遭受污染时，要将芽孢完全杀灭会很困难，正因为如此，GMP 要求采取一切必要的措施防止污染。
2．相对湿度
在热力灭菌中，水对杀灭细菌芽孢起着重要作用。与水相关的灭菌方式只有两种：湿热和干热。湿度达到饱和[相对湿度(RH)为100％(或aw＝1.0)]时的灭菌方式称为湿热灭菌；相对湿度低于100％条件下的灭菌方式统称干热灭菌。实验数据表明，温度在90～125℃之间，相对湿度在20％～50％时，细菌芽孢较难杀灭；当相对湿度高于50％或低于20％时，则较易杀灭。这对选择灭菌条件具有指导意义。
3．曝热时间
灭菌过程中，原核细胞的死亡(被杀灭)遵循一级反应的规则。温度与某一时间芽孢存活对数间的关系，在许多情况下呈线性。这就是说，在特定的灭菌温度下，任一时间孢子死亡仅与这个时间孢子的浓度相关，而使孢子数下降一个对数单位所需时间并不受孢子原始浓度的影响。本章第三节中将对此作专门讨论。
三、热力灭菌的对数规则
1．灭菌机理
组成细胞的蛋白质分子的功能取决于它的特殊结构，在一定高温条件下受热时，蛋白质分子内氢键发生断裂影响了分子空间构型的重排，从而导致微生物的死亡。对这一课题进行的大量的研究表明，细菌孢子，尤其是芽孢杆菌和梭状芽孢具有耐热性。耐热孢子的破坏取决于在水分条件下孢子的水合作用以及核酸和蛋白质的变性。因此，蒸汽灭菌中使用饱和蒸汽是至关重要的。
饱和蒸汽的穿透性比干热空气及过热蒸汽的穿透性要强得多。蒸汽冷凝时放出的潜热(2.27kJ/g)传给被灭菌品，使之升温并使被灭菌品所带的微生物尤其是表面微生物发生水合作用，从而加速了它们的死亡。
2．对数规则的数学模式
长期以来，人们进行了大量的探索及研究工作，以解决蒸汽灭菌无定量标准的难题。研究的对象主要是耐热孢子，因为生长态菌在灭菌过程中很容易被杀灭。研究的课题是在蒸汽灭菌过程中，微生物的死亡(被杀灭)所遵循的规律。研究的结果表明，将活的微生物看做反应物，并将杀灭后的微生物看做生成物，孢子的死亡基本符合质量作用定律。因为这一研究以阿伦尼乌斯一级反应为基础，故被认为是经典理论。
湿热灭菌的对数规则始于1921 年Bigeow 发表的论文——用对数规则阐述灭菌工艺过程，Rahn 等人对此进行了详细的研究，使对数规则更系统化了。按照他们的理论，灭菌时微生物的死亡遵循对数规则，灭菌过程可以用阿伦尼乌斯(Arrhenius)的一级反应式来描述。根据质量作用定律，在恒定温度及保持其他条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0 时原有的数目，即
dN／dt＝K(N0－Nk) (3－1)
式中，N0 为t＝0 时，存活的微生物数；Nk 为t 时被杀灭的微生物数；N 为t 时存活的微生物数。
如果把普通坐标(图3－4)换成半对数坐标，则可得到一直线，见图3－5。
将式(3－1)积分得到：
lgNt＝lgN0－(K／2.303)t (3－2)
3．灭菌工艺有关参数及其相关性
(1) D 值——微生物耐热参数 系指一定温度下将微生物杀灭90％或使之下降一个对数单位所需的时间(分)。D 值的大小直观地反映了微生物的热耐受性，中国药典附录灭菌法中耐热参数的提法由此而定。有的学者曾将D 值译作九成杀灭时间，内涵并无差异。
按D 的定义，将t＝D，Nt＝1／10N0 代人式(3－2)并化简：
D(K／2.303)＝lgN0－lgNt＝lgN0／Nt＝lgl0＝1
所以D＝2.303／K
即，D 是直线方程式(3－2)斜率的负倒数。D 值越大，该温度下微生物的耐热性就越强，在灭菌中就越难杀灭。对某一种微生物而言，在其他条件保持不变的情况下，D 值随灭菌温度的变化而变化(图3－6)。
灭菌温度升高时，直线方程式(3－2)的斜率变大，即使微生物杀灭90％所需的时间就短(图3－7)。
USP收载的生物指示剂嗜热脂肪杆菌(B.Stearothermophilus)的孢子在121℃下的D 值在1．5～3min 之间。不同温度下，不同的微生物在不同的环境条件下具有各不相同R 的D 值，这可以从表3－51 汇总的数据看出。
表3－51 不同灭菌温度下的D 值
(2) Z 值——灭菌温度系数 Z 值系指使某一种微生物的D 值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数(图3－8)。
在灭菌温度不大的变化范围内，温度T 和D 的对数值之间可设定为线性函数。于是有
lgD2＝lgD1+S(T2－T1) (3－3)
式中，S 为方程(3－3)的斜率；D1 及D2 分别为T1 和T2 度下的D 值。
不难看出，Z 是直线方程(3－3)斜率的负倒数，即
Z＝(T1－T2)／(1gD2—lgDl)
不同的微生物孢子，在不同的溶液中有各不相同的Z 值。
同种孢子的Z 值在不同溶液中亦有差异。表3－52 列举了嗜热脂肪杆菌在不同溶液中的Z 值。
表3－52 嗜热脂肪杆菌在不同溶液中的Z 值
在没有特定要求时，Z 值通常都取10，以简化计算。
Z 值被用于定量地描述孢子对灭菌温度变化的敏感程度，Z 值越大，孢子对温度变化的敏感性越弱，此时，企图通过升高灭菌温度的方式来加速杀灭微生物的收效就不明显。这可通过表3－53 及按表所作的图3－9 来理解。
表3－53 不同Z 值下，D121℃=1．5 的孢子在不同温度下的D 值表
按表中数据，可得Z 值与灭菌温度关系图。
如果Z＝10℃，则110℃下的D 值为18．99min。Z＝7℃时，直线的斜率增大，此时D值升到57．67min。当Z=12℃时，情况正相反，D 值降至12．38min。当灭菌温度上升时，这3 种微生物孢子相应D 值变化幅度随Z 值的增大而减少的趋势是显而易见的。
(3) FT 值——T(℃)，灭菌时间 FT 值指T(℃)灭菌值，系指一个给定Z 值下，灭菌程序在温度T(℃)下的等效灭菌时间。
FT＝DT×ΔlgN (3－4)
式中，DT 为在T(℃)下微生物的D 值；ΔlgN 为T(℃)下灭菌程序使微生物数下降的对数单位数。
如果ΔlgN＝1，则FT＝DT，当药液灭菌前微生物总数为N0时，则在T(℃)将其全部杀灭至100 所需的时间为 FT＝DT×lgN0。因此可以把FT 理解为T(℃)灭菌值，即灭菌程序赋予被灭菌品在T(℃)下的灭菌时间(图3－10)。低于121℃灭菌的程序在企业并不少见，特别是小容量注射剂，有些品种只能在105℃灭菌30min，当人们说F105℃，为30min 时，应当包括了升温及降温对杀灭微生物所起的热效应，因此灭菌程序的保温时间实际不足30min。
由于D 值随灭菌温度的变化而变化，所以不同温度下达到相同灭菌效果时，FT 值将随 D 值变化而变化。灭菌温度高时，所需的T(℃)灭菌时间就短；灭菌温度较低时，则所需的T(℃)灭菌时间就长。
(4) F0 值——标准灭菌时间 在FDA 的大容量注射剂GMP 草案中，F0 系灭菌过程赋予一个产品121℃下的等效灭菌时间。BPl993 对F0 的定义是：将121℃及Z＝10℃作为参照标准，F0 系指被灭菌品在灭菌过程中获得参照标准条件下相同灭菌效果的曝热时时间，因此，应当把121℃理解为标准灭菌温度，F0 则是标准灭菌时间，要是没有标准，对灭菌程序作量
化的比较就无从谈起。
(5) 灭菌率L L 指在某一温度T(℃)下灭菌lmin 所获得的标准灭菌时间。L 没有单位。现讨论标准灭菌时间F0 与和T(℃)灭菌时间FT 之间的关系。
从式(3－3)已知 Z＝(T1－T2)／(1gD2－1gDl)
令T2＝121℃，T1＝T 代人上式
Z＝(T 一121)／(1gDl21℃－1gDT) (3－5)
1gDl21℃－lgDT＝1g(D l21℃／DT)＝(T－121)／Z
D l21℃／DT＝10(T—121)／z (3－6)
从式(3－4)，FT＝DT×ΔlgN
则 F0＝D l21℃×Δ1gN (3－7)
FT＝DT×Δ1gN (3－8)
达到同样灭菌效果时，式(3－7)、式(3－8)中Δ1gN 等值。
所以 F0／FT＝D121℃／DT＝10(T－121)／Z
灭菌率 L＝10(T—121)／Z＝F0／FT (3－9)
上式中通常取Z＝10℃。
表3－54 列举了Z＝10℃时不同温度下的灭菌率值，比较110℃和121℃的灭菌率，可以得出结论：①110℃灭菌12．6min 和121℃灭菌lmin 等效；②灭菌时间相等时，110℃灭菌效果只有121℃下灭菌效果的7．9％。
不同温度，不同Z 值下的灭菌率(Lethal rate)见表3－55。
温度和灭菌率之间的关系可以用图3－11 来说明。
表 3－54 Z＝10℃时不同温度下的灭菌率和 1 21℃下灭菌 1rain时所相当的 T(℃)灭菌时间
表3－55 湿热灭菌中不同温度和Z 值下的灭菌率(L)数据
温度低于100℃时，灭菌率L 低得几乎可忽略不计，随着灭菌温度的上升，L 值变大。在超过121℃时，L 值随温度上升急剧增加。根据这一原理，当被灭菌品为手术刀、不锈钢器具时，通常采用高温灭菌法，温度可超过121℃，以缩短灭菌时间；对药物产品而言，过高的温度容易造成产品降解或稳定性方面问题，一般不采用超过121℃的灭菌温度。
(6)无菌标准的数学模式 我国及欧、美药典都把无菌保证值不得大于百万分之一作为最终灭菌产品无菌保证的要求，在文字说明中，常用Sterility Assurance Level(SAL) ≤10－6 的提法，但在F0 计算时，则使用以下定义
SAL(无菌保证值)＝－lg(微生物存活概率) (3－10)
药典对最终灭菌的要求赋予对数规则以新的内涵，它的数学模式也因此发生了变化。设湿热灭菌产品微生物存活概率为P，产品灭菌前初始污染菌数为N0，污染菌的耐热参数为 DT，这些参数与灭菌时间FT 之间存在如下关系式：
lgP＝lgN0－FT／DT (3－11)
化简得： FT／DT ＝1gN0－lgP
FT＝(1gN0－lgP)DT
把P＝10－6 代人，则
FT＝DT×lgN0+6×DT (3－12)
6×DT＝FT－DT×lgN0 (3－13)
如果所选用的灭菌温度为121．1℃，那么，式(3－13)中T(℃)灭菌时间用F0 来表，微生物耐热参数应使用D121.1℃，从式(3－13)可得到以下药典无菌保证通用表示式：
F0≥6×Dl21℃+D l21℃×lgN0
或 (F0－D l21℃×lgN0)／D l21℃≥6 (3－14)
从(3－14)可以看出，F0 从两个方面对产品的无菌保证作出贡献，一是将孢子杀灭至100(图3－12 中A 段)，二是为产品提供无菌保证值(图3－12 中B)，使孢子存活的概率再下降6 个对数单位，FDA 将SAL 称为最低安全系数(A minimum safety factor)，一是说明了它的安全性，二则表明它是最终灭菌产品无菌保证的最低要求。
(7) D 值测定法
① 不生长分数法。在注射剂协会及药品生产企业协会(干热灭菌及去热原验证)(专题技术报告3)对D 值的测定已有详细阐述。不生长分数法又称阴性分数法，D 值测试需专用特殊设备，如生物指示剂耐热性测定仪(BIER vessel)，它在灭菌过程中形成矩形脉冲曲线，即升温及降温极快，能保持恒定的温度，曝热过程容易计时。此测定法的假设条件是微生物存活数从
N0 到灭菌终点始终与曝热时间呈线性关系(对数规则)。实验的具体方法有两种。一种称最可能数测定法(Most probable number method)，仅需一次加热就可估算出 D 值。将一组样品(至少10 个样本)置于设定灭菌温度下，加热到设定时间后，取出并分别作无菌检查。该方法检测灵敏度高于平板计数法。当灭菌温度T 为121℃时，可用下式计算D 值。
DT=F0／lgN0－1g[2.3031g(n／q)] (3－15)
式中n——样品总数；
q——曝热处理后的无菌样品数。
另一种方法实验时每组至少需要10 个样品，将其置于预定温度下，设置不同的曝热时间，但曝热的时间间隔相同，热处理后，将样品取出，放人无菌液体培养基中，于适宜温度下培养 。培养结束时，记录每组样品中没有微生物生长的样品数，并按表3－56进行排列。
表 3－56 阴性分数法估算 D值[每组中无微生物生长样品数(f)／每组样品数(n)]
选择从全部生长(0／10)的最长曝热时间到显示完全不生长(10／10)的最短曝热时间之间的数据计算D 值。从表中可知，本次试验中的两个时间分别是5min 和15min。孢子完全杀灭(存活孢子数小于1)时间(t)可用式(3－16)计算。
t＝tk－d／2－(d／10×Σf) (3－16)
式中 tk——阴性分数范围的下限(全部样品不长菌所需的最短曝热时间)；
d——曝热时间间隔。
由表3－55 数据计算，得到：
t=15－1－(2／10×26)＝8．8min
然后，按式(3－17)计算D 值。
D＝t／(1gN0+0．2507) (3－17)
② 存活曲线法。该法至少需要测试两个样品，并在设定温度下(如121℃)分别取两个不同的曝热时间，热处理样品及对照样品(未经热处理)中的微生物数可采用两种方法：平皿计数法或经薄膜过滤并置于适当培养基表面培养的方法。在培养终点，对每个样品中的存活微生物(Ns)进行计数，再将实验数据的平均值取常用对数(1g)，并对相应的曝热时间F0(以分钟为单位)作图，可得到图3－13 所示的存活曲线。
在存活曲线上，从微生物差值为一个对数单位的二个点分别作×轴和y 轴的相平行线，在×轴上即可求得D 值；也可用式(3－18)计算。
Dl21℃＝F0／(1gN0－lgNs) (3－18)
举例，D 值测定中曝热时间为5min，而lgN0 为5，lgNs 为2，则
D121℃＝5／(5－2)＝1.7min
从图3－13 中也可看出，D 值为存活曲线斜率的负倒数(－1／K)。因此，D 值可在存活曲线的直线段，用未加权最小二次方线性回归分析法按下式求得。
以上式中，F0 为曝热时间(min)；y 为曝热条件下存活菌落数的平均值；n 指所得初验数据的组数。
(8) 对数规则在非湿热灭菌领域的应用 经典的对数理论问世以来，国外很多学者对灭菌过程中微生物死亡的规律进行了大量的实验工作，并对测定的结果进行了统计分析，结果表明，有的孢子在灭菌时存活的对数值和灭菌时间成好的线性关系，另一些则成非线性的关系。参见图3－14 及说明。
在图3－14，A 指初期滞呆型曲线；B 指始末滞呆型曲线；C 指非均一性存活曲线。
与此同时，有不少学者提出了一些新的理论来解释非线性原因，如多致命点理论，孢子耐热非专—性理论认为一个细胞一个以上的致命点灭活后，细胞才会死亡。孢子耐热非专一性理论认为孢子的耐热性在灭菌过程中是变化的。这些理论过于复杂，难以在实际工作中应用。于是，人们又从3个方面，即科学性，计算结果的安全性及使用的简便性对对数规则进行了再评价。经典的对数规则经受住了考验并在实践中获得了发展。昔日在蒸汽灭菌领域起家的对数规则，如今对干热灭菌、气体灭菌及辐射灭菌的适周已众所周知。不管所采用的灭菌方法是热力学的、化学的还是辐射的，在一定的灭菌条件下，微生物的死亡均遵循对数规则。D 值，即是微生物下降一个对数单位所需的时间或辐射剂量，可从下式算出或根据实验结果用作图法求得。
D＝U／(1gN0－lgN0)
式中，U 系指给定灭菌条件下的灭菌时间或辐射剂量；N0 是芽孢的初始数值；Nu 是灭菌后存活的孢子数。
经典理论的发展拓宽了它在灭菌领域的应用范围并为灭菌程序的设计和验证提供了方便条件。应当注意，在辐射灭菌法中，D 系微生物耐辐射参数，意指使污染菌下降一个对数单位所需的剂量。
(9) 干热灭菌 如前所述，干热灭菌是指在非饱和湿度下进行的热力学灭菌。因此，干热灭菌时的相对湿度范围可从99．9％至1％以下。干热灭菌的介质通常是被灭菌品所处湿度下的热空气，在灭菌过程中，通过强制方式将热空气对流。随着热空气将水分逐渐带走，被灭菌物品及芽孢跟着失水，从而导致灭菌率发生相应的变化。
干热灭菌与湿热灭菌的动力学特征相似，但反应机理却有所不同。干热灭菌是使微生物氧化而不是蛋白质变性，因此，干热灭菌需要较高的温度条件。
在制药工业中，干热灭菌被广泛用于热稳定性好、但又不能经受高压蒸汽灭菌的物品，如甘油、油类、凡士林、石蜡。此外，它还可用于某些粉状的药物组分如滑石粉、磺胺类药物以及玻璃和不锈钢设备的灭菌。
在干热灭菌中，取170℃为参照温度，相应的灭菌时间以FH 表示。尽管干热灭过程中孢子的耐热性会发生一些变化，但药典规定的无菌保证值已有了相当的安全性，因此，除 Z 取20℃外，灭菌率的计算式与湿热灭菌相同。
(10) 干热去热原 内毒素是革兰阴性菌细胞壁外侧的脂多糖类物质(Lipopolysaccharides)，其中磷脂多糖体是其活性中心，致热作用最强。磷脂多糖体是由多糖(葡萄糖、半乳糖、庚糖、H—乙酰葡萄糖胺等糖组成)通过KDO(2－Keto－3－deo×yoetonate)键而与磷脂A(LipidA)结合组成一个单位结构，许多这样的单位结构组成长链的巨大分子。磷脂多糖体的化学组成因菌种不同而异，从大肠杆菌分离出来的磷脂多糖体中有68％～69％的糖， 12％～13％的类脂化合物，7％的有机磷和其他一些成分。磷脂多糖体的相对分子质量约为 5×104～5×105，也有人认为是7×105～7×107，相对分子质量越大致热作用也越大。由于低剂量内毒素注入人体后便会导致发热反应，故而也称之为热原。任何旨在去除产品中所含的脂多糖的工艺过程均称为去热原工艺。
干热法是最为有效的去热原方法之一。但是，去热原要求的温度很高，如170～250℃，甚至更高。在170℃下去热原速度很慢，需约30min 方能使纯内毒素下降1 个对数单位，而在250℃下达到同样效果仅需9s。对干热去热原工艺进行验证时，通常直接向待去热原物品中加入已知量的内毒素，然后证明该工艺能使内毒素至少下降3 个对数单位。在去热原计算中，L 的计算式相同，参照温度取170℃，Z 取54℃。
